一、GPI-PLD基因表达在K562细胞对补体杀伤的敏感性中的影响（论文文献综述）
卢珍[1]（2020）在《肿瘤AMPK活化促进NK细胞抗肿瘤免疫协同增强PD-L1阻断疗法的研究》文中指出癌症是世界范围内危害人类健康的主要死亡因素。虽然目前以程序性死亡受体-1/程序性死亡配体-1（programmed cell death protein-1/programmed death ligand-1,PD-1/PD-L1）通路阻断为代表的免疫检查点阻断疗法在临床上已经取得了令人惊喜的效果,然而,只有一部分肿瘤患者对该疗法有响应。因此,对抗肿瘤免疫的调控机制进行深入的研究、进一步提高患者对肿瘤免疫疗法的应答,具有重要的社会意义。自然杀伤细胞（natural killer cells,NK cells）是机体抗肿瘤免疫监视的重要组成部分。研究发现,肿瘤中NK细胞的浸润与患者良好的预后成正相关,并能增强机体对免疫检查点阻断疗法的应答。目前,基于NK细胞的肿瘤免疫疗法已经在恶性肿瘤的临床试验中显示出良好的效果。此外,越来越多的研究表明,肿瘤微环境代谢可能是影响抗肿瘤免疫反应和免疫治疗疗效的重要因素。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）是细胞能量代谢的感受器,在肿瘤微环境等代谢压力的诱导下可被激活,通过触发代谢重编程调控细胞的生存。AMPK已经被证明在肿瘤发展中发挥环境依赖性作用,既具有抑制肿瘤生长的作用,也能够促进肿瘤的发展。然而,肿瘤AMPK在机体抗肿瘤免疫监视以及免疫检查点阻断疗法中的作用,目前尚不清楚。本研究对肿瘤AMPK活化对NK细胞介导的肿瘤免疫监视和PD-L1阻断疗法的影响进行了研究。我们首先构建了anti-PD-L1应答的肿瘤模型和anti-PD-L1不应答的肿瘤模型,通过分析肿瘤组织的蛋白表达,我们发现,AMPK的活化水平在anti-PD-L1应答的肿瘤中显着升高、而在anti-PD-L1不应答的肿瘤中没有差异。使用药物抑制AMPK活化显着削弱PD-L1阻断疗法的治疗效果。这说明,肿瘤AMPK活化对于PD-L1阻断治疗疗效的发挥具有重要作用。同时,我们也验证了NK细胞在PD-L1阻断治疗中的作用。为了研究AMPK活化和NK细胞这两种对PD-L1阻断治疗具有重要作用的因素之间的相互关系,我们使用AMPK的激活剂—二甲双胍,也是临床治疗2型糖尿病的一线药物,来诱导AMPK活化。结果显示,二甲双胍诱导的AMPK活化以NK细胞依赖的方式显着抑制小鼠肿瘤的生长。在体外,二甲双胍诱导的AMPK活化可以促进肿瘤细胞对NK细胞介导的杀伤作用的敏感性。另外,我们通过构建肝激酶B1（liver kinase B1,LKB1）过表达的细胞系来诱导AMPK活化,进一步确认了AMPK活化对NK细胞抗肿瘤免疫的促进作用。转录组学分析结果显示,AMPK活化显着促进了模式识别受体通路相关基因的富集,并伴随着有益趋化因子基因表达的上调,这与黑色素瘤患者更高的生存率相关。进一步的机制研究表明,AMPK活化可能通过诱导错误折叠蛋白的过度积累,从而使肿瘤细胞更容易被NK细胞杀伤。更重要的是,我们的研究发现,不管是二甲双胍还是LKB1过表达诱导的AMPK活化与PD-L1阻断抗体联用时,表现出明显的协同抑制肿瘤生长的作用。综上所述,本研究首次发现细胞能量感受器AMPK的活化对PD-L1阻断治疗疗效的发挥具有关键作用。AMPK活化通过促进NK细胞介导的抗肿瘤免疫发挥抑制肿瘤生长的作用,并能协同增强PD-L1阻断疗法的治疗效果。这些结果提示,在临床治疗中增强肿瘤AMPK的活化具有提高肿瘤免疫治疗疗效的潜力。
袁宪宇,刘立鹏,沈运兰,唐建华[2]（2012）在《GPI-PLD调节CEA的释放对白血病HL-60细胞的增殖和凋亡的影响》文中研究说明糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D（glycosyl phosphatidyl inositol specific phospholipase D,GPI-PLD）是人体内唯一可水解细胞膜表面GPI结构、调节GPI锚定蛋白释放的酶.将GPI-PLD转染入急性粒细胞白血病（AGL）的HL-60细胞株,采用实时荧光定量PCR法和Western blot法确定转染后HL-60细胞内GPI-PLD的表达水平;并检测GPI-PLD活性;噻唑蓝（MTT）检测HL-60细胞的增殖;流式细胞仪检测HL-60细胞的凋亡.ELISA检测GPI锚定癌胚抗原（CEA）的表达和释放情况.转染GPI-PLD后,HL-60细胞株中GPI-PLD表达量与活性增加;MTT检测显示,GPI-PLD过表达后HL-60细胞株增殖生长受到抑制;流式检测证实HL-60细胞凋亡增加;且GPI锚定的蛋白质CEA释放增加.该结果提示GPI-PLD基因有抗肿瘤的作用,过表达GPI-PLD后能抑制HL-60细胞增殖且促进其凋亡,所涉机制可能与GPI-PLD释放GPI锚定蛋白,增强白血病细胞对补体杀伤的敏感性有关.
邓黎黎[3]（2012）在《黄芪多糖对白血病细胞MICA表达及NK细胞杀伤敏感性的影响》文中提出目的：NK细胞是机体固有免疫的主要免疫细胞,在机体早期抗肿瘤和免疫监视中具有重要作用,是机体抗肿瘤的第一道免疫杀伤防线。活化性受体NKG2D与靶细胞上相应的配体（NKG2D-L）结合在NK细胞介导的抗肿瘤反应中起着关键作用。然而,研究发现大部分白血病细胞低表达活性受体NKG2D相应的配体,使得它们对NK细胞介导免疫反应产生了免疫逃逸；因此,我们有必要寻求新的药物去上调NKG2D-L-或低表达的白血病细胞表面NKG2D-L的表达,来增强其对NK细胞的杀伤敏感性以提高白血病治疗疗效。本研究立足于观察黄芪多糖是否能上调白血病细胞HL-60、K562中的NKG2D相应的配体MICA表达及增强其对NK细胞杀伤敏感性,为以NK细胞为基础的白血病免疫治疗寻求新靶点。方法：将不同浓度的黄芪多糖分别与HL-60细胞、K562细胞共孵育48小时后,利用CCK-8法检测黄芪多糖对HL-60、K562细胞的半数抑制量（IC50）,以此含量作用HL-60、K562细胞48小时后,采用RT-PCR、流式细胞仪分别检测作用前后白血病细胞MICA基因和蛋白水平的表达变化。运用乳酸脱氢酶释放法检测NK细胞对黄芪多糖处理前后HL-60、K562细胞的杀伤率。结果：经黄芪多糖处理后HL-60细胞MICA mRNA表达是处理前的1.46±0.16倍,而经黄芪多糖处理后的K562细胞MICA mRNA表达是处理前的2.26±0.34倍,差异有显着性（P<0.05）；HL-60细胞MICA表达率由处理前的（6.34±0.81）%升至处理后的（10.35±1.68）%；而K562细胞MICA表达率由处理前的（42.29±±1.57）%升至处理后的（65.02±±2.24）%；差异有统计学意义（P<0.05）；且NK细胞对黄芪多糖作用前后HL-60、K562细胞的杀伤率,在不同效靶比（5：1、10：1、20：1）下均有显着差异,差异有统计学意义（P<0.05）。结论：1.黄芪多糖作用后白血病细胞HL-60、K562的MICA mRNA及MICA表达均显着上调；2.黄芪多糖能可以通过上调白血病细胞MICA的表达增强白血病细胞对NK细胞的杀伤敏感性。
向新颖,唐红梅,胡正茂,夏昆,唐建华[4]（2011）在《鼻咽癌患者糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D活性及其表达水平的初步研究》文中研究表明目的①通过研究正常人和鼻咽癌患者的糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D（GPI-PLD）的酶活性和酶促反应的3-D图,探索鼻咽癌患者该酶活性的变化情况及该酶促反应的可能机制。②通过研究正常人和鼻咽癌患者GPI-PLD mRNA的表达水平,探寻鼻咽癌患者该酶活性变化的可能机制,为鼻咽癌的诊断、预后估计提供有效指标。方法①采用我室自制的具完整GPI结构的胎盘型碱性磷酸酶（PLAP）作底物进行酶促反应,测定正常人和鼻咽癌患者GPI-PLD的酶活性并应用韩国新科有限公司生产的Photodiode Array Uv-Vis Spectrophotometer仪器研究了该酶的催化机理,并且利用该机所带软件作出3-D图。②采用逆转录PCR（RT-PCR）检测正常人和鼻咽癌患者的GPI-PLD mRNA的表达水平,以RT-PCR结果的琼脂糖电泳照片的积分光密度值（IA）比值代表GPI-PLD mRNA的表达水平。结果①正常人和鼻咽癌患者血清GPI-PLD的活性水平（均以转化底物百分比表示）分别为17.6%±2.7%和20.6%±2.4%,鼻咽癌患者的血清GPI-PLD活性比正常人血清GPI-PLD活性显着增高（P<0.05）。并且其酶促反应的3-D图显示有直观差异。2.RT-PCR检测GPI-PLD mRNA的表达,结果表明正常人鼻咽上皮细胞中GPI-PLD mRNA琼脂糖电泳照片的平均积分光密度比值（IA比值）是2.6131±0.7653,鼻咽癌患者鼻咽上皮细胞中GPI-PLD mRNA琼脂糖电泳照片的平均积分光密度比值（IA比值）是9.3522±5.2879,鼻咽癌患者的GPI-PLD mRNA的表达水平比正常人鼻咽上皮细胞中GPI-PLD mRNA的表达水平显着性增高（P<0.05）。结论①鼻咽癌患者的血清GPI-PLD活性比正常人显着增高,其酶促反应的3-D图也与正常人有明显差异,提示测定GPI-PLD活性可作为临床诊断鼻咽癌的生化指标。②鼻咽癌患者GPI-PLD mRNA的表达水平高于正常人。GPI-PLD mRNA表达增强是导致鼻咽癌患者GPI-PLD酶活性增高的主要机制。
邹翔[5]（2010）在《莱菔硫烷诱导人肝瘤HepG-2细胞G2/M期阻滞及凋亡的机制研究》文中认为据不完全统计,我国每年新增癌症病人160万。据WHO预测,到2020年世界癌症患者将增加到1470万人。因此,恶性肿瘤仍是本世纪严重危害人类健康的主要疾病之一。其中,肝癌是恶性程度很高的消化系肿瘤之一,在全世界范围内每年发病人数62.6万,发病率在全部恶性肿瘤中位居第六；每年死亡人数58.9万,致死率仅次于肺癌和胃癌位列全部癌症的第三位,且病死率呈逐年升高的趋势。目前,肝癌的治疗方法主要以手术、放疗和化疗为主,但这些方法大都毒副作用较大,很多患者最终不是死于癌症本身而是死于放化疗产生的毒副作用。因此,新型高效低毒抗癌药物的研制开发已经成为优化肿瘤治疗策略以及最终攻克癌症的希望所在。莱菔硫烷（sulforaphane, SFN）是天然存在于十字花科植物中含有的一种异硫氰酸盐（isothiocyanates, ITCs）类物质,是十字花科植物中的硫代葡萄糖苷的酶解产物,在绿花椰菜中含量最高。大量研究表明,异硫氰酸盐可选择性地抑制Ⅰ相酶的活性,诱导Ⅱ相酶的活性,降低致癌物的活化,保护机体少受甚至不受损伤,显示出很强的化学预防作用。目前认为,SFN不仅在肿瘤发生的多个阶段发挥抑癌作用,而且它还是潜在的肿瘤治疗药物。SFN与肿瘤的关系研究正成为抗肿瘤药物研究领域的热点。虽然关于肿瘤发病机制的学说很多,但总而言之,肿瘤是一类细胞周期紊乱和凋亡异常性疾病。以调控细胞周期和诱导细胞凋亡为靶点,寻找相关药物用于恶性肿瘤的治疗为抗肿瘤药物的研究提供了新的思路。本论文前期研究发现,绿花椰菜中的ITCs能够诱导人肝癌细胞系HepG-2细胞发生凋亡,进一步研究发现SFN是其中含量最高、活性最强的抗肝癌细胞活性成分。因此,本论文在前期工作的基础上,以人肝癌HepG-2细胞为对象,从细胞周期调控和诱导凋亡入手,系统研究SFN的抗肿瘤作用机制,为今后SFN作为抗肝癌药物的开发提供科学依据。1莱菔硫烷抑制人肝癌HepG-2细胞增殖和诱导凋亡作用的研究1.1莱菔硫烷对人肝癌细胞HepG-2增殖抑制作用研究目的：研究SFN对人肝癌HepG-2细胞增殖的抑制作用。方法：采用MTT比色法和SRB法测定SFN对人肝癌HepG-2细胞增殖的抑制率,计算SFN对人肝癌HepG-2细胞的IC50和GI50；采用倒置显微镜观察细胞生长状态。结果：MTT法测定结果表明,不同浓度的SFN（5、10、20、40、80μmol/L）作用于HepG-2细胞24、48、72 h均可显着抑制细胞增殖（P<0.05或P<0.01）,并呈一定的时间和剂量依赖性。经计算,SFN对HepG-2细胞24,48和72 h的IC50分别为32.03μmol/L±0.96μmol/L,20.90μmol/L±1.96μmol/L和13.87μmol/L±0.44μmol/L。SRB法测定结果表明,SFN作用于HepG-2细胞48h的IC50为21.80μmol/L,GI50为19.40μmol/L,与MTT结果相印证。倒置相差显微镜下观察到对照组细胞贴壁生长,细胞饱满,边缘清晰；而SFN作用后,贴壁细胞减少,细胞均逐渐变圆,体积变小,折光性减弱。结论：SFN对人肝癌HepG-2细胞的增殖具有较强的抑制作用。1.2莱菔硫烷对人肝癌HepG-2细胞周期影响的研究目的：研究SFN对人肝癌HepG-2细胞周期阻滞作用。方法：采用PI单染法,应用流式细胞仪分析SFN作用于人肝癌HepG-2细胞后细胞周期的分布变化。结果：10、20、40μmol/L的SFN作用HepG-2细胞48h后,各组G2/M期的细胞比例显着升高,且G2/M期细胞百分比随着药物浓度增加而增大,同时G1期细胞明显减少。SFN浓度达到40μmol/L时出现凋亡峰。结论：SFN可诱导人肝癌HepG-2细胞发生G2/M期阻滞。1.3莱菔硫烷诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡作用的研究目的：研究SFN对人肝癌HepG-2细胞凋亡诱导作用。方法：采用一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒原位检测DNA片段化情况；采用Annexin V-FITC/PI双染,激光共聚焦显微镜观察细胞的早期凋亡情况；透射电镜观察肿瘤细胞超微结构变化；采用流式细胞仪（Annexin V-FITC/PI双染法）测定细胞凋亡率。结果：TUNEL法检测结果表明,SFN作用48h后,激光共聚焦显微镜下早期凋亡细胞核显绿色荧光。随着SFN剂量的增加凋亡细胞数量逐渐增多,而空白对照组细胞无明显着色。激光共聚焦显微镜下可见早期凋亡细胞的细胞膜被染成绿色,细胞核无明显着色。细胞膜被染成绿色,细胞核被染成红色是晚期凋亡细胞或坏死细胞。随着剂量的增加,镜下凋亡细胞数量也逐渐增加。电子显微镜下可见对照组细胞的细胞结构清晰,细胞器结构完整,核内染色质分布均匀,线粒体结构正常,细胞表面有微绒毛突起。而SFN作用后,细胞出现典型的凋亡形态,如微绒毛减少,细胞核内染色质固缩、凝集于核膜边界,形成新月状小体,核周间隙扩张,线粒体肿胀,胞浆空泡化,细胞形成凋亡小体。流式细胞仪检测结果表明,10、20、40μmol/L的SFN作用于HepG-2细胞48h后,早期凋亡细胞百分率分别达到27.42%±0.43%、46.53%±0.35%和58.92%±0.48%,与对照组1.6%±0.06%比较,差异有统计学意义（P<0.01）。结论：SFN可诱导人肝癌HepG-2细胞发生凋亡。2莱菔硫烷诱导人肝癌HepG-2细胞G2/M期阻滞及凋亡的机制研究2.1莱菔硫烷诱导人肝癌HepG-2细胞G2/M期阻滞的机制研究目的：研究SFN诱导人肝癌HepG-2细胞G2/M期阻滞的分子作用机制。方法：采用Western Blot法检测SFN对人肝癌HepG-2细胞内CdKl,p-CdKl（Thr14）, cyclinB1,Cdc25C,p21等G2/M期相关蛋白表达的影响。结果：10、20、40μmol/L的SFN作用HepG-2细胞48 h后,均可显着下调CdKl, cyclinB1, Cdc25C蛋白表达水平,与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.01）,同时显着上调p-CdKl（Thr14）和p21蛋白表达水平,与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。结论：SFN可通过降低CdK1-cyclinB1复合物的形成,同时通过下调Cdc25C表达、上调p21表达来抑制CdK1或CdKl-cyclinBl复合物的活性,诱导HepG-2细胞发生G2/M期阻滞。2.2莱菔硫烷通过线粒体途径诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡的机制研究目的：研究SFN诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡的分子作用机制。方法：采用酶活力检测试剂盒测定SFN对人肝癌HepG-2细胞Caspase-3,-8,-9活性的影响,采用激光共聚扫描焦显微镜测定细胞内线粒体膜电位（Δψm）和钙离子浓度,采用流式细胞仪测定人肝癌HepG-2细胞内ROS含量；采用Western blot法测定SFN对HepG-2细胞内Cyt-c蛋白表达的影响：采用Western blot法和RT-PCR法测定SFN对HepG-2细胞内Bcl-2、Bax表达的影响。结果：不同浓度的SFN作用于HepG-2细胞48h后,细胞线粒体膜电位Δψm随着SFN浓度的升高而逐渐降低,呈一定的剂量依赖关系；20、40μmol/L组FI值与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.01）。细胞内钙离子浓度随着SFN浓度的升高而逐渐升高。10、20、40μmol/L SFN剂量组细胞内[Ca2+]i（FI）分别为45.68±10.51、88.62±16.09和176.33±25.14,与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.01）。同时,细胞内活性氧水平显着升高,分别为28.74±4.59、52.90±6.61和90.32±5.95,与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.01）。RT-PCR法和Western blot法检测结果表明,SFN能下调HepG-2细胞中Bcl-2 mRNA和蛋白的表达水平,同时上调Bax mRNA和蛋白表达水平,且Bcl-2/Bax和Bcl-2mRNA/Bax mRNA随剂量的增加而降低,与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。此外,SFN可上调细胞内Cyt-c蛋白表达量,并呈一定的剂量依赖性,与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。试剂盒检测结构表明,SFN可升高细胞内Caspase-3,-8,-9活性,并呈一定的剂量依赖性,各剂量组与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。结论：SFN可能是通过下调Bcl-2基因表达、上调Bax基因表达,进而诱导线粒体通透性转变孔道（PT孔道）的开放,促进线粒体内Cyt-c向胞浆的释放。释放的Cyt-c可能进一步与Apaf-1、procaspase-9结合形成凋亡体,活化的caspase-9进一步激活下游的caspase-3,最终完成SFN通过线粒体途径诱导HepG-2细胞的凋亡过程。2.3莱菔硫烷通过MAPK信号转导途径诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡机制研究目的：阐明MAPK信号传导通路在SFN诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡中的作用。方法：采用Western blot法研究SFN对人肝癌HepG-2细胞中MAPK信号通路相关蛋白P38、p-P38、ERK、p-ERK、JNK/SAPK和p-JNK/SAPK蛋白表达的影响。结果：10、20、40μmol/L的SFN作用人肝癌HepG-2细胞48h后,随着药物浓度的增加,p-P38和p-JNK蛋白表达量逐渐增加,而p-ERK的表达量逐渐降低,与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。同时,P38、ERK和JNK蛋白相对表达量与对照组相比并无显着性差异（P>0.05）。结论：MAPK信号转导途径在SFN诱导人肝癌HepG-2细胞周期阻滞和凋亡过程中发挥重要作用,SFN可通过启动MAPK信号通路诱导人肝癌HepG-2细胞G2/M期阻滞进而引起细胞凋亡。结论SFN对人肝癌HepG-2细胞具有显着地抗肿瘤作用,其可能的作用机制如下：①SFN可通过降低CdK1-cyclinB1复合物的形成,同时通过下调Cdc25C表达、上调p21表达来抑制CdK1或CdK1-cyclinB1复合物的活性,诱导HepG-2细胞发生G2/M期阻滞；②SFN可通过下调Bcl-2基因表达、上调Bax基因表达,进而诱导线粒体通透性转变孔道（PT孔道）的开放,促进线粒体内Cyt-c向胞浆的释放,进而激活caspase-9和下游的caspase-3,最终通过线粒体途径诱导HepG-2细胞发生凋亡；③SFN可通过激活p38MAPK信号转导通路,作用于Cdc25C磷酸酶而使其失活,导致其无法激活Cdk1而将细胞阻滞于G2/M期；同时,通过促进fas/fasL介导的细胞凋亡途径激活Caspase-8,启动Caspase级联反应而诱导HepG-2细胞凋亡,但这一推测仍有待研究证实；④SFN可通过下调p-ERK的表达抑制ERK通路的激活,进而抑制Bcl-2所致的抗凋亡作用,促进细胞凋亡；⑤SFN可通过促进JNK的磷酸化促进线粒体介导的细胞凋亡；同时,激活Fas/FasL介导的细胞凋亡途径而激活Caspase-8,最终激活Caspase-3诱导细胞凋亡；活化的JNK/SAPKs还可通过翻译后的磷酸化修饰稳定p21的活性,进而抑制Cdkl的活化,诱导细胞发生G2/M期阻滞。本研究的创新点1.首次研究发现启动G2/M期DNA损伤检查点调节机制是SFN诱导人肝癌HepG-2细胞周期阻滞的主要分子机制。2.首次研究发现线粒体介导的凋亡通路是SFN诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡的主要途径,下调Bcl-2基因表达、上调Bax基因表达是SFN启动内源性凋亡通路的关键。3.首次研究发现MAPK信号通路是SFN诱导人肝癌HepG-2细胞G2/M期阻滞和凋亡的关键调节通路和重要作用靶点。
王锴佳[6]（2010）在《胰岛素诱导肝癌HepG2细胞株GPI-PLD基因的表达及其免疫学效应》文中指出目的初步研究胰岛素对HepG2细胞GPI-PLD基因表达和GPI-PLD酶活性的影响,以及对细胞膜上GPI锚定蛋白质如CEA分子的释放改变,这些效应是否能够提高淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）杀伤HepG2细胞和GPI-PLD基因转染HepG2细胞的敏感性。方法用阳离子聚合物将本室已经构建的真核表达载体pcDNA3.1 （+）/GPI-PLD转入HepG2细胞,以未转染的HepG2细胞组、阳离子聚合物处理组以及转染空载体pcDNA3.1（+）的细胞组为对照,G418筛选出阳性细胞克隆。RT-PCR法鉴定GPI-PLD基因的mRNA表达水平,利用自制具完整GPI结构的胎盘型碱性磷酸酶（PLAP）做底物,定量检测GPI-PLD酶活性。利用胰岛素分别诱导HepG2细胞以及稳定转染GPI-PLD基因的HepG2细胞48h,RT-PCR检测各组细胞GPI-PLD基因的mRNA表达水平；利用自制具完整GPI结构的胎盘型碱性磷酸酶（PLAP）做底物,定量检测GPI-PLD酶活性；ELISA检测各组细胞CEA的释放情况；流式细胞术检测细胞表面GPI锚定的CEA分子的变化。IL-2诱导从正常人外周血分离的外周血单个核细胞。高倍镜下观察LAK细胞与各组HepG2细胞按20：1的效靶比共育12h后的情况,MTT法检测LAK细胞对各组细胞的杀伤效应。结果RT-PCR分析和GPI-PLD酶活性测定表明,稳定高表达GPI-PLD的HepG2细胞系已经建立。胰岛素（10-6mol／L）诱导HepG2细胞以及稳定转染GPI-PLD基因的HepG2细胞48h后：1.RT-PCR测定表明诱导后,HepG2细胞组GPI-PLD基因的mRNA表达水平明显高于诱导前细胞的表达水平,统计具有显着性差异（P<0.01）,而稳定转染GPI-PLD基因的HepG2细胞诱导前后GPI-PLD基因的mRNA表达水平增高不明显；2.诱导后HepG2细胞组细胞的GPI-PLD酶活性明显高于诱导前细胞的酶活性,统计具有显着性差异（P<0.01）,而稳定转染GPI-PLD基因的HepG2细胞诱导前后GPI-PLD酶活性增高不明显；3.诱导后HepG2细胞释放的CEA分子和诱导前相比明显增多,并且,膜上GPI锚定的CEA分子比诱导前细胞减少,差异具有统计学意义（P<0.01）,而稳定转染GPI-PLD基因的HepG2细胞诱导后释放的CEA分子增加不明显,而诱导后膜上GPI锚定的CEA分子比诱导前细胞减少,统计具有显着性差异（P<0.01）。LAK细胞与各组HepG2细胞按20：1的效靶比共育12h后,HepG2细胞组和诱导HepG2细胞组、稳定转染GPI-PLD基因的HepG2细胞组以及诱导稳定转染GPI-PLD基因的HepG2细胞组相比,靶细胞周围的LAK细胞相对减少,形成的细胞团块也不明显。MTT法检测显示,LAK细胞对诱导后HepG2细胞的杀伤活性和诱导前细胞相比,杀伤活性增加,统计具有显着性差异（P<0.01）,而胰岛素诱导转染组杀伤活性和诱导前转染组相比,杀伤活性也有增加,统计具有差异（P<0.05）。结论1.建立了稳定表达GPI-PLD的HepG2细胞株。2.胰岛素能够诱导HepG2细胞GPI-PLD基因过表达,GPI-PLD活性增加。同时,细胞膜上GPI锚定的CEA减少,从而增加LAK细胞杀伤HepG2细胞的敏感性。
贺望娇,唐建华,谭超超,段琼,王锴佳,左克强,袁宪宇[7]（2008）在《GPI-PLD过表达对肝癌细胞株HepG2生物学特征的影响》文中提出目的:研究GPI-PLD基因转染并过度表达对HepG2细胞的影响。方法:用脂质体转染法将本室已经构建的GPI-PLD真核表达载体pcDNA3.1（+）/GPI-PLD转入HepG2细胞,以未转染的HepG2细胞及转染空载体pcDNA3.1（+）的细胞为对照,G418筛选出阳性细胞克隆。用自制具完整GPI结构的胎盘碱性磷酸酶为底物,定量检测GPI-PLD活性,RT-PCR法确定GPI-PLD mRNA表达水平。细胞计数绘制生长曲线,荧光染色观察HepG2细胞形态学改变,流式细胞术检测凋亡,台盼蓝排斥法观察补体介导的细胞毒（CDC）杀伤率,ELISA检测癌胚抗原（CEA）的表达情况。结果:阳性细胞克隆GPI-PLD酶活性水平比对照组升高约2倍,GPI-PLD mRNA表达水平约增加5倍;GPI-PLD基因过度表达可促进GPI锚定的蛋白质如CEA和PLAP等被大量水解释放入培养基,导致细胞增殖能力减弱,对补体杀伤的敏感性增强,细胞呈现典型的凋亡形态特征,流式细胞术检测到凋亡峰,细胞凋亡率明显增加。结论:成功将GPI-PLD基因转染入HepG2细胞,并在细胞中稳定表达。GPI-PLD过表达能抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞的凋亡,增强肿瘤细胞对补体杀伤的敏感性。
贺望娇[8]（2007）在《GPI-PLD基因过表达对肝癌HepG2细胞株的影响》文中进行了进一步梳理目的：用糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D（GPI-PLD）基因转染肝癌HepG2细胞，初步研究GPI-PLD基因过度表达对肝癌细胞株HepG2细胞的影响，包括对其生长及凋亡、细胞膜上糖基化磷脂酰肌醇（GPI）锚定的蛋白质释放情况等方面的影响，为肝癌的GPI-PLD基因治疗提供理论依据。方法：用脂质体转染法将本室已经构建的GPI-PLD真核表达载体pcDNA3.1（+）／GPI-PLD转入HepG2细胞，以未转染的HepG2细胞及转染空载体pcDNA3.1（+）的细胞为对照，以G418筛选出阳性细胞克隆。RT-PCR法鉴定GPI-PLD基因的mRNA表达水平，利用自制具完整GPI结构的胎盘型碱性磷酸酶（PLAP）做底物，通过曲拉通-114（TX-114）分相，定量检测GPI-PLD活性；基因转染后细胞生物学特性的观察包括MTT法检测各组细胞增殖活性，细胞计数绘制生长曲线，荧光染色观察HepG2细胞形态学改变，台盼蓝排斥法观察补体介导的细胞毒（CDC）杀伤率；运用ELISA检测GPI锚定癌胚抗原（CEA）的表达和释放情况，分光光度法检测GPI锚定PLAP的表达和释放情况。结果：1．RT-PCR结果和GPI-PLD酶活性测定表明，稳定高表达GPI-PLD的HepG2细胞系已经建立。①G418筛选后，GPI-PLD稳定转染HepG2细胞的GPI-PLD mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染组明显增高，差异有显着性（P＜0.05），各组细胞GPI-PLDmRNA的相对表达量用积分分光密度比值（IA比值）表示，分别为0.926±0.124、0.164±0.057和0.205±0.045。②GPI-PLD稳定转染HepG2细胞后，GPI-PLD活性较转染空质粒组和未转染组明显增高，差异有显着性意义（P＜0.01），各组细胞的GPI-PLD活性（％）分别为13.4±4.44、4.82±2.99和6.52±2.34。③GPI-PLD转染HepG2细胞后，GPI锚定的蛋白质如CEA、PLAP等被GPI-PLD水解释放入培养基，GPI-PLD转染组细胞培养基上清CEA浓度较其他两组明显增高，具有显着性差异（P＜0.01），超声粉碎细胞上清和细胞培养基上清PLAP的活性测定，转染空质粒组和未转染细胞组PLAP活性主要分布于超声粉碎细胞上清液中，而GPI-PLD转染组细胞PLAP活性绝大部分分布于细胞培养液。2．GPI-PLD基因过度表达对HepG2细胞有影响。①GPI-PLD稳定转染HepG2细胞后，GPI-PLD转染组较转染空质粒组和未转染组细胞增殖能力明显减弱。②GPI-PLD稳定转染HepG2细胞后，较转染空质粒组和未转染组细胞对补体杀伤的敏感性增强，具有显着性差异（P＜0.01），各组细胞的杀伤率（％）分别为16.4±2.10、5.7±1.15、5.9±1.39。③GPI-PLD稳定转染HepG2细胞后，呈现典型的凋亡细胞形态特征。结论：1．成功将GPI-PLD基因转染入HepG2细胞，并在细胞中稳定表达。2．本试验证实GPI-PLD基因有抗肿瘤的作用。即通过上调GPI-PLD活性，释放GPI锚定蛋白，增强肿瘤细胞对补体杀伤的敏感性，促进肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖。本试验为肿瘤GPI-PLD基因治疗奠定了理论与实验基础。
唐建华[9]（2006）在《GPI-PLD基因表达水平对CML白血病细胞免疫清除的影响》文中研究说明研究背景：糖基化磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）锚定蛋白质是真核生物细胞质膜上非常重要的一类膜蛋白。GPI特异性磷脂酶D（GPI-PLD）能选择性地水解GPI锚定蛋白质中的肌醇磷酸酯键，释放出锚定蛋白，影响GPI锚定蛋白质的表达和生物学功能。该酶活性可受多种因素，包括脂多糖、氧化剂、葡萄糖和胰岛素等的影响和调控。肝脏、胰腺和骨髓是人血浆GPI-PLD的重要来源。本课题组已经从人骨髓基质细胞中克隆出GPI-PLD完整cDNA（长度2.6kb，GenBank accession number AY007546），这为进一步研究GPI-PLD创造了条件。GPI锚定蛋白质如CD55、CD59等是重要的免疫分子，T淋巴细胞的活化和增殖也涉及到富含GPI锚定蛋白、胆固醇、鞘糖脂、G蛋白和PTK的脂微区来实现信号转导。GPI锚定蛋白质结构的完整性对其发挥生理活性很重要，例如GPI锚定的CD55、CD59水解成可溶形式后，水溶性CD59的功能就不完全，抑制补体的能力下降。慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）是造血组织的一种恶性肿瘤，其白血病细胞BCR-ABL融合基因表达的产物属src癌基因家族，具有PTK激酶活性。已经有报道提示白血病细胞的某些GPI锚定蛋白质的表达和功能都可能存在异常。对一些白血病细胞株如K562、HL-60、U937等检测发现，它们均可表达GPI-PLD，但其表达水平都非常低，而且不同细胞株表达的水平有差异。因此，白血病细胞中GPI锚定蛋白和GPI-PLD水平变化与白血病的发生和发展可能有一定的联系。为了研究CML患者GPI-PLD和GPI锚定CD55、CD59的表达水平以及它们之间的关系，GPI-PLD和GPI锚定蛋白质在CML发病中可能的分子机制，白血病K562细胞株的GPI-PLD活性和表达水平是否会影响到免疫系统对它的杀伤作用，以及GPI-PLD与肿瘤免疫逃逸是否有密切联系，研究者设计本实验，初步探讨和解决这些问题。方法：1．应用竞争性定量RT-PCR技术确定正常人和CML患者外周血单个核细胞中GPI-PLD mRNA的表达水平，采用我室自制的具完整GPI结构的胎盘型碱性磷酸酶（PLAP）作底物测定正常人和CML患者GPI-PLD的酶活性，流式细胞术分析外周血单个核细胞表面GPI锚定CD55和CD59的表达水平，Western-Blotting结合TX-114分相技术检测GPI-PLD对GPI锚定CD55和CD59的释放。2．采用基因克隆技术构建GPI-PLD cDNA真核表达载体，脂质体转染K562细胞，G418筛选稳定转染、过度表达GPI-PLD的阳性克隆细胞株，通过检测GPI-PLD mRNA的表达水平和酶活性以及对GPI锚定CD55和CD59的释放，确定基因转染是否成功。3．用胰岛素作为诱导剂分别对野生型K562细胞株和稳定转染GPI-PLD基因阳性克隆的K562细胞株进行诱导试验，观测GPI-PLDmRNA的表达水平、酶活性和GPI锚定CD55、CD59的释放变化。4．台盼蓝排斥法观测K562细胞GPI-PLD水平改变对补体介导的细胞毒作用的杀伤率变化，MTT比色法判断T淋巴细胞对K562细胞在不同GPI-PLD水平时的杀伤率。结果：1．检测110名正常人和80例CML患者，发现CML患者外周血单个核细胞和血浆中GPI-PLD活性水平（均以释放GPI锚定的PLAP的百分率表示）的平均值（x±s）为21.2±2.8％与28.9±3.6％，显着性低于正常人的水平（相应为41.7±3.8％和41.9±4.5％），其单个核细胞和血浆中酶活性水平减少的幅度分别为100％和70％（P＜0.001）。进一步分析发现，CML患者单个核细胞GPI-PLD活性仅为其血浆中酶活性水平的75％（P＜0.001），但正常人单个核细胞和血浆中GPI-PLD酶活性水平无显着性差异（P＞0.05）。2．竞争性定量RT-PCR方法检测20名正常人和20例CML患者的GPI-PLD mRNA的表达水平。结果表明，正常人和CML患者外周血单个核细胞GPI-PLD mRNA表达水平的平均值（x±s）相应为1.237×103±42拷贝／ng总RNA和0.438×103±30拷贝／ng总RNA，正常人GPI-PLD mRNA表达水平显着性高于CML患者（P＜0.001），大约为其3倍。其中6例CML患者经骨髓移植治疗成功后，GPI-PLD活性和mRNA表达水平均基本恢复至正常人的水平。3．流式细胞术分析20名正常人和40例CML患者，发现其外周血单个核细胞GPI锚定CD55和CD59分子均显示阳性，但其荧光强度的数值范围正常人较CML患者要弥散一些。正常人CD55和CD59分子的荧光强度值范围相应在330.7至673.8和545.6到782.4；CML患者其数值范围相应在438.8至478.6和641.2到704.6；CML患者单个核细胞表面CD55和CD59表达水平的平均值（x±s）相应为537.2±25与747.9±35，正常人相应为458.0±13与677.4±19，CML患者这两种分子的表达水平都显着性高于正常人（P＜0.05）。4．成功构建了GPI-PLD cDNA的真核细胞表达载体pcDNA3.1（+）／GPI-PLD，筛选到了稳定高表达GPI-PLD活性的K562细胞株。阳性克隆细胞株的GPI-PLD活性和mRNA表达水平比阴性包括空载体阳性对照组K562细胞都相应提高了约6和7倍，功能鉴定还显示阳性克隆细胞表面的GPI锚定CD55和CD59分子数量均显着性减少，仅为对照组的一半。5．用10-7mol／L浓度的胰岛素诱导野生型K562细胞株24h和48h，可导致诱导细胞的GPI-PLD mRNA表达水平和GPI-PLD活性水平同步增高4倍和7倍；诱导稳定转染型K562细胞株24h和48h，可使它们在原有高表达水平上再增高约10％和20％。6．Western-Blotting结合TX-114分相技术检测野生型K562细胞和稳定转染型K562细胞，经胰岛素诱导后，发现其细胞内的GPI-PLD活性水平不同，保留在细胞膜上的GPI锚定型CD55和CD59的量，以及出现于细胞培养液中的水溶性CD55和CD59的量也不同，这证明释放反应由GPI-PLD催化实现。7．胰岛素诱导24h和48h后，野生型K562细胞的补体杀伤率由诱导前的6.44±0.22％显着性增高到12.19±0.14％和18.79±0.42％，增高的百分率分别为189％和293％；阳性克隆K562细胞经胰岛素诱导24h和48h后，其补体杀伤率也在原有高杀伤率（18.40±0.41％）基础上显着性增高到20.87±0.70％和25.28±0.26％，增高的百分率分别为112％和137％。而且，GPI-PLD酶活性与补体介导的细胞毒杀伤率成正相关，相关系数为0.975。8．胰岛素诱导24h和48h后，野生型K562细胞被T淋巴细胞的杀伤率由诱导前的8.45±0.32％显着性增高到26.77±0.37％和32.70±0.43％，增高的百分率分别为316％和507％；阳性克隆K562细胞经胰岛素诱导24h和48h后，其T淋巴细胞杀伤率也在原有高杀伤率（36.81±0.31％）基础上显着性增高到43.72±0.12％和49.30±0.28％，增高的百分率分别为119％和133％。GPI-PLD酶活性与T淋巴细胞的杀伤率也成正相关，相关系数为0.959。结论：1．首次报道CML患者白血病细胞GPI-PLD活性和表达水平比正常人显着性减少，经骨髓移植治疗成功后，两者可恢复至正常人的水平；白血病细胞膜上GPI-PLD活性低下可导致细胞表面GPI锚定CD55和CD59的数目显着性增加。2．首次成功建立稳定高表达GPI-PLD cDNA的白血病K562细胞株。3．发现胰岛素诱导K562细胞株可导致GPI-PLD基因过度表达及GPI-PLD活性显着性增加，与此同时，细胞表面GPI锚定CD55和CD59的分子数量均显着性减少，细胞被补体和T淋巴细胞的杀伤率都相应增加。4．首次阐述和证实GPI-PLD参与了CML发病的分子机制，它与肿瘤的免疫逃逸也密切相关。
王依丹,唐建华,杨智英,禹虹,向新颖[10]（2004）在《GPI-PLD基因表达在K562细胞对补体杀伤的敏感性中的影响》文中指出目的 :观察葡萄糖、胰岛素诱导K5 6 2细胞GPI PLD基因表达对GPI锚定CD5 5 ,CD5 9的影响 ,以及对补体依赖的细胞毒 （complementdependentcytotoxicity ,CDC）杀伤K5 6 2细胞的影响。方法 :采用免疫印迹检测CD5 5和CD5 9表达 ,定量测定GPI PLD酶活性 ,台盼蓝排斥法观察CDC杀伤率。结果 :诱导 2 4h及 4 8h ,胰岛素组、葡萄糖 +胰岛素组酶活性、杀伤率明显增高。 2 4h时对照组、葡萄糖组、胰岛素组膜蛋白检出CD5 5 ,对照组、葡萄糖组膜蛋白及胰岛素组、葡萄糖 +胰岛素组培养基中检出CD5 9。 4 8h时对照组膜蛋白 ,葡萄糖组、胰岛素组、葡萄糖 +胰岛素组培养基检出CD5 5 ,CD5 9。结论 :胰岛素诱导使K5 6 2细胞的GPI PLD酶活性明显升高 ,导致GPI锚定CD5 5和CD5 9释放进入培养基 ,K5 6 2细胞对补体杀伤的敏感性增强
二、GPI-PLD基因表达在K562细胞对补体杀伤的敏感性中的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、GPI-PLD基因表达在K562细胞对补体杀伤的敏感性中的影响（论文提纲范文）
（1）肿瘤AMPK活化促进NK细胞抗肿瘤免疫协同增强PD-L1阻断疗法的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 肿瘤发生、发展与免疫系统 |
| 1.1.1 肿瘤免疫监视学说 |
| 1.1.2 肿瘤免疫编辑学说 |
| 1.2 肿瘤免疫疗法 |
| 1.2.1 肿瘤免疫疗法的种类与发展 |
| 1.2.2 PD-1/PD-L1免疫检查点阻断疗法 |
| 1.3 NK细胞与肿瘤免疫 |
| 1.3.1 NK细胞简介 |
| 1.3.2 NK细胞的抗肿瘤机制 |
| 1.3.3 基于NK细胞的肿瘤免疫疗法 |
| 1.3.4 NK细胞在PD通路阻断疗法中的作用 |
| 1.4 AMPK与肿瘤发生 |
| 1.4.1 AMPK简介 |
| 1.4.2 AMPK通路在肿瘤发生发展中的作用 |
| 1.5 本文研究的目的和意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物与细胞系 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验耗材 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞系的培养与传代 |
| 2.2.2 LKB1过表达细胞系的构建 |
| 2.2.3 人原代NK细胞的制备与培养 |
| 2.2.4 小鼠脾脏NK细胞的制备与培养 |
| 2.2.5 小鼠肿瘤模型的构建 |
| 2.2.6 小鼠NK细胞清除实验 |
| 2.2.7 Anti-PD-L1 抗体体内给药实验 |
| 2.2.8 Compound C体内给药实验 |
| 2.2.9 小鼠TILs的分离与检测 |
| 2.2.10 NK细胞杀伤肿瘤细胞实验 |
| 2.2.11 NK细胞与靶细胞结合实验 |
| 2.2.12 NK细胞活化检测 |
| 2.2.13 细胞凋亡检测 |
| 2.2.14 细胞增殖检测 |
| 2.2.15 蛋白免疫印迹分析 |
| 2.2.16 转录组测序和基因富集分析 |
| 2.2.17 统计学分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 PD-L1 阻断治疗促进肿瘤AMPK的活化 |
| 3.2 二甲双胍诱导的AMPK活化使肿瘤对NK细胞介导的抗肿瘤免疫监视更敏感 |
| 3.2.1 二甲双胍诱导的AMPK活化抑制肿瘤在免疫正常小鼠体内的发展 |
| 3.2.2 二甲双胍诱导的AMPK活化不显着影响TILs的数量和功能 |
| 3.2.3 二甲双胍诱导的AMPK活化以NK细胞依赖的方式抑制肿瘤生长 |
| 3.3 二甲双胍诱导的AMPK活化促进肿瘤细胞对NK细胞介导的杀伤作用的敏感性 |
| 3.3.1 二甲双胍预处理使肿瘤细胞对NK细胞的杀伤更敏感 |
| 3.3.2 二甲双胍预处理促进NK细胞脱颗粒marker CD107a的表达 |
| 3.3.3 二甲双胍预处理促进肿瘤细胞与NK细胞的结合 |
| 3.3.4 二甲双胍增强肿瘤细胞对NK杀伤的敏感性依赖AMPK |
| 3.4 LKB1 诱导的AMPK活化促进NK细胞介导的抗肿瘤免疫监视 |
| 3.4.1 LKB1 过表达诱导的AMPK活化抑制小鼠肿瘤的生长 |
| 3.4.2 LKB1 诱导的AMPK活化对TILs的数量和功能的影响不显着 |
| 3.4.3 LKB1 过表达诱导的AMPK活化抑制肿瘤生长的作用依赖NK细胞 |
| 3.4.4 LKB1 过表达诱导的AMPK活化促进肿瘤细胞对NK细胞杀伤的敏感性 |
| 3.5 LKB1过表达促进肿瘤细胞模式识别受体和有益趋化因子的表达 |
| 3.6 AMPK活化通过诱导错误折叠蛋白的积累增强肿瘤细胞对NK细胞介导的杀伤作用的敏感性 |
| 3.7 肿瘤AMPK的激活协同增强anti-PD-L1 免疫治疗的疗效 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 攻读学位期间发表的学术论文与取得的其它研究成果 |
（2）GPI-PLD调节CEA的释放对白血病HL-60细胞的增殖和凋亡的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞和试剂 |
| 1.2 转染 |
| 1.3 qRT-PCR检测GPI-PLD mRNA表达水平 |
| 1.4 Western blot法测定GPI-PLD蛋白的表达 |
| 1.5 GPI-PLD酶活性水平测定 |
| 1.6 MTT法检测细胞增殖 |
| 1.7 Annexin V-FITC标记流式检测细胞凋亡 |
| 1.8 ELISA法检测CEA的表达 |
| 1.9 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 qRT-PCR法检测GPI-PLD mRNA的表达水平 |
| 2.2 Western blot检测GPI-PLD蛋白的表达水平 |
| 2.3 细胞GPI-PLD酶活性测定结果 |
| 2.4 MTT法检测GPI-PLD的过表达对HL-60细胞增殖的影响 |
| 2.5 Annexin V-FITC流式检测过表达GPI-PLD对HL-60细胞凋亡的影响 |
| 2.6 过表达GPI-PLD对HL-60细胞分泌CEA表达的影响 |
| 3 讨论 |
（3）黄芪多糖对白血病细胞MICA表达及NK细胞杀伤敏感性的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验细胞 |
| 2. 实验分组 |
| 3. 观察指标 |
| 4. 所用药物 |
| 5. 试剂、仪器和材料 |
| 5.1 试剂 |
| 5.2 仪器和材料 |
| 6. 实验方法 |
| 6.1 CCK-8法检测黄芪多糖对HL-60、K652细胞的IC50值 |
| 6.2 RT-PCR检测黄芪多糖作用前后HL-60、K562细胞表面MICAmRNA的表达 |
| 6.3 流式细胞仪测定黄芪多糖作用前后HL-60、K562细胞表面MICA的表达水平 |
| 6.4 乳酸脱氢酶释放测定法检测NK细胞对黄芪多糖处理前后靶细胞的杀伤活性 |
| 7. 统计学处理 |
| 8. 技术路线图 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 硕士期间研究成果 |
| 附录 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（4）鼻咽癌患者糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D活性及其表达水平的初步研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 标本 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 RT-PCR引物 |
| 1.5 正常人及鼻咽癌患者的血清GPI-PLD酶活性测定 |
| 1.6 计算 |
| 1.7 提取正常人和鼻咽癌患者的标本的总RNA |
| 1.8 RT-PCR检查GPI-PLD m RNA的表达水平 |
| 1.9 统计处理 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（5）莱菔硫烷诱导人肝瘤HepG-2细胞G2/M期阻滞及凋亡的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 综述一 细胞凋亡途径和信号机制研究进展 |
| 1 细胞凋亡的线粒体途径研究进展 |
| 1.1 BCL-2家族 |
| 1.2 线粒体通透性转换孔 |
| 1.3 细胞色素C |
| 1.4 凋亡诱导因子 |
| 1.5 SMAC/DIABLO |
| 1.6 CASPASE家族 |
| 2 细胞凋亡的死亡受体途径研究进展 |
| 2.1 FAS/FASL信号途径 |
| 2.2 TNFR1信号途径 |
| 2.3 DR4和DR5的信号途径 |
| 2.4 DR3的信号传导途径 |
| 3 细胞凋亡的MAPK信号转导通路途径研究进展 |
| 3.1 MAPK信号转导通路 |
| 3.2 MAPK与肿瘤细胞凋亡 |
| 参考文献 |
| 综述二 G_2/M检查点调控机制研究进展 |
| 1 G_2/M检验点的调控机制 |
| 1.1 CDC2(CDK1)/CYCLINB1 |
| 1.2 CDC2的表达与G_2/M检验点 |
| 1.3 CYCLIN B1的表达与G_2/M检验点 |
| 1.4 CDC2-CYCLIN B1的活性与G_2/M检验点 |
| 1.5 CDC2-CYCLIN B1的定位与G_2/M检验点 |
| 2 CDC25家族 |
| 2.1 CDC25的表达与G_2/M检验点 |
| 2.2 CDC25的磷酸化及亚细胞定位与G_2/M检验点 |
| 3 参与G_2/M检验点调控的其它细胞因子 |
| 参考文献 |
| 综述三 十字花科植物中硫代葡萄糖苷和莱菔硫烷研究进展 |
| 1 硫代葡萄糖苷的研究 |
| 1.1 硫苷的化学结构及分类 |
| 1.2 硫苷的科属分布情况 |
| 1.3 硫苷的分离 |
| 1.4 硫苷的降解产物及其影响因素 |
| 1.5 硫苷的药理作用 |
| 2 莱菔硫烷的研究进展 |
| 2.1 莱菔硫烷的化学研究 |
| 2.2 莱菔硫烷药理作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一部分 莱菔硫烷抑制人肝癌HEPG-2细胞增殖和诱导凋亡作用的研究 |
| 实验一 莱菔硫烷对人肝癌细胞HEPG-2增殖抑制作用的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 莱菔硫烷对人肝癌HEPG-2细胞细胞周期分布影响的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 莱菔硫烷诱导人肝癌HEPG-2细胞凋亡作用的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 小结 |
| 第二部分 莱菔硫烷诱导人肝癌HEPG-2细胞G_2/M期阻滞及凋亡的机制研究 |
| 实验一 莱菔硫烷诱导人肝癌HEPG-2细胞G_2/M期阻滞的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 莱菔硫烷通过线粒体途径诱导人肝癌HEPG-2细胞凋亡的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 莱菔硫烷通过MAPK信号途径诱导人肝癌HEPG-2细胞凋亡的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 小结 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）胰岛素诱导肝癌HepG2细胞株GPI-PLD基因的表达及其免疫学效应（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词汇表 |
| 前言 |
| 实验技术路线图 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株、正常人外周血、菌种和重组质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 携带pcDNA3.1(+)/GPI-PLD质粒的TG1大肠杆菌扩增培养及提取 |
| 2.2 重组质粒pcDNA3.1(+)/GPI-PLD转染HepG2细胞、筛选并鉴定 |
| 2.3 胰岛素对HepG2细胞以及转GPI-PLD基因HepG2细胞诱导 |
| 2.4 诱导前后各组细胞被LAK细胞杀伤敏感性的改变 |
| 2.5 统计学分析 |
| 第二章 结果 |
| 1.质粒提取酶切结果 |
| 2.经G418筛选稳定转染组及对照组细胞GPI-PLD酶活性测定结果 |
| 3.细胞总RNA提取及鉴定结果 |
| 4.RT-PCR法检测GPI-PLD基因mRNA的表达量变化 |
| 5.胰岛素诱导48h后细胞GPI-PLD酶活性测定结果 |
| 6.胰岛素诱导后RT-PCR法检测GPI-PLD基因mRNA的表达量变化 |
| 7.ELISA法检测诱导前后各组细胞培养液中CEA的浓度 |
| 8.诱导前后各组细胞表面锚定CEA的流式细胞术分析 |
| 9.MTT法优化LAK细胞杀伤靶细胞作用的条件 |
| 10.LAK细胞分别与诱导前后四组细胞共育的形态学观察结果 |
| 11.MTT法检测LAK细胞对诱导前后各组细胞杀伤活性的改变 |
| 第三章 讨论 |
| 1.肝脏、肝细胞癌与GPI-PLD |
| 2.胰岛素诱导HepG2细胞GPI-PLD基因的表达 |
| 3.肿瘤细胞表面GPI锚定的CEA与LAK细胞对其杀伤活性相关 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要的研究成果 |
（7）GPI-PLD过表达对肝癌细胞株HepG2生物学特征的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组质粒pcDNA3.1 (+) /GPI-PLD转染HepG2细胞、筛选并鉴定 |
| 1.2.2 GPI-PLD酶活性水平测定 |
| 1.2.3 ELISA检测GPI锚定CEA |
| 1.2.4 分光光度法测定GPI锚定PLAP |
| 1.2.5 基因转染后细胞生物学特性 |
| 1.2.5.1 荧光染色 |
| 1.2.5.2 流式细胞术检测凋亡 |
| 1.2.5.3 生长曲线测定 |
| 1.2.6 补体介导的细胞毒实验 (台盼蓝排斥法) |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结 果 |
| 2.1 RT-PCR法检测GPI-PLD |
| 2.2 细胞GPI-PLD酶活性测定结果 |
| 2.3 稳定转染的HepG2细胞释放GPI锚定CEA水平测定 |
| 2.4 稳定转染的HepG2细胞释放GPI锚定PLAP的检测 |
| 2.5 基因转染后细胞生物学特性观察 |
| 2.5.1 细胞生长曲线 |
| 2.5.2 细胞凋亡形态观察 |
| 2.5.3 流式细胞术检测凋亡峰 |
| 2.6 补体介导的细胞毒试验 |
| 3 讨 论 |
（8）GPI-PLD基因过表达对肝癌HepG2细胞株的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词汇表 |
| 前言 |
| 实验技术路线图 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 携带pcDNA3.1(+)/GIP-PLD质粒的TG1大肠杆菌扩增培养及鉴定 |
| 2.2 重组质粒pcDNA3.1(+)/GPI-PLD转染HepG2细胞、筛选并鉴定 |
| 2.3 HepG2细胞GPI-PLD酶活性水平测定 |
| 2.4 ELISA检测GPI锚定CEA |
| 2.5 分光光度法测定GPI锚定PLAP |
| 2.6 基因转染后细胞生物学特性 |
| 2.7 补体介导的细胞毒试验(台盼蓝排斥法) |
| 2.8 统计学分析 |
| 第二章 结果 |
| 1 质粒提取鉴定结果 |
| 2 稳定转染GPI-PLD基因后G418筛选的结果 |
| 3 细胞总RNA提取及鉴定结果 |
| 4 RT-PCR法检测GPI-PLD基因mRNA的表达量变化 |
| 5 细胞GPI-PLD酶活性测定结果 |
| 6 稳定转染的HepG2细胞释放GPI锚定CEA水平测定 |
| 7 稳定转染的HepG2细胞释放GPI锚定PLAP的检测 |
| 8 基因转染后细胞生物学特性观察 |
| 9 补体介导的细胞毒试验 |
| 第三章 讨论 |
| 1 肝脏、肝细胞癌与GPI-PLD |
| 2 GPI-PLD对肿瘤细胞的影响 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间完成、发表论文情况 |
（9）GPI-PLD基因表达水平对CML白血病细胞免疫清除的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词汇表 |
| 前言 |
| 技术路线图 |
| 第一章 慢性粒细胞白血病患者GPI-PLD基因的表达水平 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 病人资料 |
| 1.1.3 方法 |
| 1.1.4 统计处理 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 正常人及CML患者GPI-PLD活性水平 |
| 1.2.2 正常人和CML患者外周血单个核细胞总RNA提取结果 |
| 1.2.3 竞争性定量RT-PCR检测外周血单个核细胞GPI-PLD mRNA的表达水平 |
| 1.2.4 CML患者骨髓移植治疗前后GPI-PLD表达水平的改变 |
| 1.2.5 正常人和CML患者外周血单个核细胞GPI锚定CD55和CD59的表达水平 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 GPI-PLD与白血病 |
| 1.3.2 影响GPI-PLD活性改变的因素 |
| 1.3.3 GPI-PLD表达水平与GPI锚定蛋白表达水平的关系 |
| 1.4 结论 |
| 第二章 建立稳定高表达GPI-PLD的转染细胞株 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 菌种、质粒和细胞株 |
| 2.1.4 方法 |
| 2.1.5 统计学处理 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 含完整GPI-PLD cDNA阳性克隆质粒的鉴定 |
| 2.2.2 pcDNA3.1(+)/GPI-PLD真核表达质粒的构建与鉴定 |
| 2.2.3 稳定转染GPI-PLD基因的K562细胞的筛选及鉴定 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 GPI-PLD基因 |
| 2.3.2 竞争性定量RT-PCR |
| 2.3.3 其它 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 胰岛素诱导GPI-PLD基因不同水平表达与K562细胞的免疫杀伤 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞株 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 K562细胞的分组诱导 |
| 3.2.2 K562细胞受诱导后GPI-PLD酶活性水平测定 |
| 3.2.3 竞争性定量RT-PCR技术确定K562细胞受诱导后GPI-PLD mRNA的表达水平 |
| 3.2.4 免疫印迹(Western-Blotting)结合TX-114分相技术检测GPI锚定CD55和CD59的释放 |
| 3.2.5 补体介导的细胞毒试验(台盼蓝排斥法) |
| 3.2.6 MTT法测定T淋巴细胞对K562细胞的杀伤率 |
| 3.2.7 统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 K562细胞经胰岛素诱导前后GPI-PLD活性改变 |
| 3.3.2 K562细胞经胰岛素诱导前后GPI-PLD mRNA表达水平 |
| 3.3.3 GPI-PLD高表达促使K562细胞释放GPI锚定CD55和CD59 |
| 3.3.4 高表达GPI-PLD的K562细胞容易被补体介导的细胞毒作用杀伤 |
| 3.3.5 高表达GPI-PLD的K562细胞容易被T淋巴细胞杀伤 |
| 3.3.6 胰岛素诱导前后野生型和阳性克隆K562细胞的一些指标体系的变化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 胰岛素诱导K562细胞GPI-PLD基因的表达 |
| 3.4.2 TX-114分相结合WB检测GPI锚定CD55和CD59的释放 |
| 3.4.3 CD55和CD59与肿瘤细胞的补体杀伤 |
| 3.4.4 MTT法测T淋巴细胞的杀瘤活性 |
| 3.4.5 GPI-PLD影响T淋巴细胞杀伤肿瘤的可能机制 |
| 3.5 结论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要的研究成果 |
（10）GPI-PLD基因表达在K562细胞对补体杀伤的敏感性中的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 分组与诱导 |
| 1.2.2 酶活性测定 |
| 1.2.3 Western blotting 将膜蛋白及培养基中沉淀的蛋白质用含2% |
| 1.2.4 补体依赖的细胞毒 (CDC) 杀伤率观察 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结 果 |
| 2.1 酶活性及CDC杀伤率 |
| 2.2 CD55和CD59 |
| 3 讨 论 |
四、GPI-PLD基因表达在K562细胞对补体杀伤的敏感性中的影响（论文参考文献）
- [1]肿瘤AMPK活化促进NK细胞抗肿瘤免疫协同增强PD-L1阻断疗法的研究[D]. 卢珍. 中国科学院大学(中国科学院深圳先进技术研究院), 2020(01)
- [2]GPI-PLD调节CEA的释放对白血病HL-60细胞的增殖和凋亡的影响[J]. 袁宪宇,刘立鹏,沈运兰,唐建华. 生命科学研究, 2012(02)
- [3]黄芪多糖对白血病细胞MICA表达及NK细胞杀伤敏感性的影响[D]. 邓黎黎. 兰州大学, 2012(10)
- [4]鼻咽癌患者糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D活性及其表达水平的初步研究[J]. 向新颖,唐红梅,胡正茂,夏昆,唐建华. 肿瘤药学, 2011(05)
- [5]莱菔硫烷诱导人肝瘤HepG-2细胞G2/M期阻滞及凋亡的机制研究[D]. 邹翔. 北京中医药大学, 2010(08)
- [6]胰岛素诱导肝癌HepG2细胞株GPI-PLD基因的表达及其免疫学效应[D]. 王锴佳. 中南大学, 2010(02)
- [7]GPI-PLD过表达对肝癌细胞株HepG2生物学特征的影响[J]. 贺望娇,唐建华,谭超超,段琼,王锴佳,左克强,袁宪宇. 中南大学学报(医学版), 2008(02)
- [8]GPI-PLD基因过表达对肝癌HepG2细胞株的影响[D]. 贺望娇. 中南大学, 2007(06)
- [9]GPI-PLD基因表达水平对CML白血病细胞免疫清除的影响[D]. 唐建华. 中南大学, 2006(01)
- [10]GPI-PLD基因表达在K562细胞对补体杀伤的敏感性中的影响[J]. 王依丹,唐建华,杨智英,禹虹,向新颖. 中南大学学报(医学版), 2004(06)