一、大鼠肝移植缺血再灌注后Kupffer细胞Toll样受体4及其伴侣分子MD-2的表达（论文文献综述）
张世龙[1]（2021）在《杜仲桃叶珊瑚苷对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究》文中指出目的:明确杜仲桃叶珊瑚苷（AU）对大鼠肝脏缺血再灌注损伤（HIRI）的保护效应;并通过体内、体外实验对其保护机制进行深入探讨。方法:1.明确杜仲AU是否通过抗炎、抗氧化发挥对HIRI的保护效应。40只雄性SD大鼠（SPF级）随机分为5组,每组8只。分别设假手术组（Sham）,杜仲AU低剂量组（AU-L）、中剂量组（AU-M）、高剂量组（AU-H）及缺血再灌注损伤组（IRI）。其中AU-L、AU-M和AU-H组分别予AU 1、5、10mg/kg·d腹腔注射,Sham、IRI组予相同体积生理盐水腹腔注射。连续预处理10d后,除Sham组外,其余各组均建立HIRI模型（70%肝脏缺血1h,再灌注6h）。收集大鼠血清及再灌注肝组织进行相关指标检测。肝脏HE染色观察再灌注肝组织病理损伤情况;全自动生化分析仪检测血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）水平,以了解肝功能损伤情况;ELISA法检测血清中高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、肿瘤坏死因子-a（TNF-a）及白细胞介素-1b（IL-1b）的含量,了解促炎细胞因子释放情况;硫代巴比妥酸法、黄嘌呤氧化酶法及荧光探针技术分别检测再灌注肝组织中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）及活性氧（ROS）生成情况,了解氧化应激水平。2.探讨杜仲AU对HIRI的保护机制。（1）杜仲AU对HIRI无菌炎症反应的影响。（1）体内实验,在整体水平上明确杜仲AU是否通过下调HMGB1的表达和/或主动分泌,影响TLR-4/NF-k B信号通路,抑制HIRI无菌炎症反应。取HIRI保护效应最优的AU组及Sham、IRI组的再灌注肝组织进行以下指标检测:实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹（WB）法分别检测HMGB1、Toll样受体4（TLR-4）及高度糖基化终产物受体（RAGE）的m RNA及蛋白水平,了解HMGB1、TLR-4及RAGE的表达情况;WB检测干扰素调节因子1（IRF-1）、免疫沉淀（IP）联合WB检测乙酰化HMGB1（Ac-HMGB1）,了解HMGB1主动分泌情况;WB检测髓样分化因子88（My D88）、核因子k B-p65（p65）、磷酸化p65（P-p65）、核因子k B抑制蛋白a（Ik B-a）、磷酸化Ik B-a（P-Ik B-a）、肝组织细胞核内p65蛋白、IL-1b及TNFa等的蛋白水平,了解杜仲AU对NF-k B炎症反应通路的影响。（2）体外实验,在细胞水平进一步明确杜仲AU对TLR-4/NF-k B通路的影响。选取人正常肝细胞株HL-7702（LO2）,构建TLR-4过表达LO2稳转细胞株。分为正常LO2组（NC）、空质粒转染组（EPT）、TLR-4过表达组（OE）、TLR-4过表达+杜仲AU组（AU）和TLR-4过表达+TLR-4受体抑制剂TAK-242组（TAK）。将各组细胞接种于6孔板,AU组和TAK组用含不同浓度AU或TAK-242的完全培养基培养48h,余下三组用普通完全培养基培养48h,收集细胞悬液。CCK-8检测杜仲AU和TAK-242对LO2细胞活力的影响;WB检测各组TLR-4、My D88、P-p65和P-Ik B-a蛋白水平,探讨杜仲AU对TLR-4/NF-k B信号通路相关蛋白的影响。（2）体内实验初步探讨杜仲AU对HIRI所致细胞凋亡的影响。取HIRI保护效应最优AU组及Sham、IRI组的再灌注肝组织进行以下指标检测:TUNEL法观察细胞凋亡现象;WB检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α（PGC-1α）、解偶联蛋白2（UCP2）、caspase3和cleaved caspase3的蛋白水平,以初步了解杜仲AU对线粒体损伤介导细胞凋亡途径的影响。结果:1.不同剂量杜仲AU对大鼠HIRI的保护效应:AU-M组病理学评分较IRI组明显降低（P<0.05）,AU-L和AU-H组病理学评分较IRI组无明显差异（P>0.05）;与IRI组相比,三种剂量杜仲AU均能下调血清中ALT、AST、TNF-a、IL-1b和HMGB1水平,减少肝组织中ROS、MDA生成,增加肝组织SOD的表达,差异均具统计学意义（P<0.05）;其中AU-M组ALT、AST、HMGB1、TNF-a、IL-1b、MDA、ROS降低及SOD升高最为显着（P<0.05）。2.杜仲AU减轻HIRI分子机制:（1）杜仲AU对无菌炎症反应的影响:（1）体内实验,相较于IRI组,AU-M组肝组织中HMGB1、TLR-4和RAGE的m RNA及蛋白水平显着降低（P<0.05）;IRF-1和Ac-HMGB1,My D88、p65、P-p65、P-Ik B-a和入核p65,以及IL-1b、TNF-a的蛋白水平均明显降低（P<0.05）;Ik B-a蛋白水平明显升高（P<0.05）。（2）体外实验,与EPT组相比,NC组的TLR-4水平无明显变化（P>0.05）,而OE组的TLR-4水平明显升高（P<0.05）;杜仲AU（8μM）和TAK-242（4μM）预处理均能够明显减少肝细胞内TLR-4、My D88、P-p65和P-IκB-α的蛋白水平（P<0.05）,且两组之间除TLR-4水平存在差异（P<0.05）,其余指标均无显着差异（P>0.05）。（2）杜仲AU对HIRI所致细胞凋亡的影响:TUNEL染色结果显示:与Sham组相比,IRI组标记凋亡细胞的荧光明显增强,荧光区域明显增大;而AUM组的荧光较IRI组明显减弱,荧光区域也明显减小。AU-M组肝组织细胞中caspase3和cleaved caspase3蛋白水平较IRI组明显降低,而PGC-1α和UCP2蛋白水平明显升高（P<0.05）。结论:1.杜仲AU（1、5、10mg/kg·d）均可通过抗炎、抗氧化作用发挥对大鼠HIRI的保护效应,以5mg/kg·d AU保护效应最佳。2.杜仲AU可通过下调HMGB1表达及减少HMGB1主动分泌,进而抑制TLR-4/NF-k B信号通路,减轻HIRI无菌炎症反应,发挥对HIRI的保护效应。3.杜仲AU还可能通过抑制线粒体损伤介导的细胞凋亡途径,发挥对HIRI的保护效应。
朱宏伟[2]（2021）在《SD大鼠自体原位肝移植缺血再灌注损伤后粪便菌群的变化规律》文中提出[目 的]构建SD大鼠自体原位肝移植缺血再灌注损伤的动物模型,探索肝移植缺血再灌注损伤后不同时间节点大鼠粪便菌群的变化规律,分析肝移植缺血再灌注损伤引起粪便菌群改变的可能机制,进而为将来从肠道菌群的角度对肝移植缺血再灌注损伤进行干预与治疗时提供指导。[方法]采用自体原位肝移植的方法构建大鼠肝脏的缺血再灌注损伤动物模型,其中模型组（M组）根据术后取材时间节点不同又分为M1、M4、M7、M10、M14、M21、M28七个组,并建立假手术组（S组）进行对照。术前分别对以上8组（n=5）大鼠进行血液、粪便标本的搜集。假手术组（S组）在术后第1天进行肝脏、肠管、血液及粪便标本的采集,模型组（M组）分别对应于术后第1d、4d、7d、10d、14d、21d、28d进行肝脏、肠管、血液及粪便标本的采集。大鼠血液进行ALT、AST、TBIL、WBC、NEUT、LYM指标的检测,从血液学角度对肝脏损伤、胆汁淤积及全身炎症情况进行评估与分级。制作并观察肝脏、回盲部肠管病理切片,从病理学角度了解肝脏组织、肠管黏膜的损伤情况。采用高通量基因测序对大鼠新鲜粪便进行检测,了解AOLT缺血再灌注损伤后粪便菌群谱的变化规律。[结 果]1、本次研究采用自体原位肝移植的方法构建肝移植缺血再灌注损伤的动物模型,建模成功率100%。在肝移植缺血再灌注损伤术后第1天,ALT、AST、TBIL指标均较假手术组明显升高,差异皆具有明显统计学意义（P<0.05）。肝脏组织病理图片显示,M1组肝脏组织呈现出较重损伤,Suzuki’ s评分3分,以上结果均证实AOLT动物模型能反映出肝脏的IRI情况,是研究肝移植IRI的理想动物模型。2、AST、ALT、TBIL与肝脏组织病理在AOLT缺血再灌注损伤术后的变化规律基本保持一致。其中,模型组M1中的AST、ALT、TBIL在术后第1天分别为 776.20±298.79、241.00±66.21 和 2.90±2.00,它们显着高于假手术组（S）及其余各模型组,与各组间比较均存在明显差异（P<0.05）,其余各模型组与假手术组（S）之间未见明显差异。由各组AST、ALT、TBIL的变化趋势图和肝脏组织的病理图片可以看出SD大鼠在经历AOLT缺血再灌注后,术后早期（第1天）肝组织损伤、胆汁淤积最为明显,进行到术后中期时肝脏的损伤明显减轻,至术后晚期（第28天）已经完全恢复至术前正常水平。3、通过对大鼠血液WBC、NEUT、LYM指标进行检测以及回盲部肠管组织病理切片的观察,我们发现AOLT缺血再灌注损伤也可导致肠管组织的损伤与炎症反应的产生,且两者的变化平行发生。各模型组中WBC、NEUT、LYMD的值均显着高于假手术组（S）,且与假手术组（S）比较的P值均小于0.05。其中由各指标的变化趋势和回盲部肠管组织病理图片可以看出炎症反应及肠道黏膜损伤在肝移植术后早期即可发生,但程度较轻;在移植术后中期（第4-14天）呈现出先增加后逐渐递减的趋势,以第7-14d炎性反应及肠道黏膜损伤表现得尤其显着;至术后晚期（第28天）观察结束时炎性指标仍略高于术前正常水平,肠道黏膜呈现轻度损伤,但均较术后中期明显好转。4、SD大鼠正常情况下粪便内菌群在门的水平上以拟杆菌门和厚壁菌门为主,且它们的比值约为1。在属的水平层面,正常大鼠粪便菌群丰度占比排名前五（丰度均>1%）的菌群依次为:乳杆菌属（Lactobacillus）、普氏菌属（Prevotella）、颤螺菌属（Oscillospira）、疣微菌科瘤胃球菌属（RuminococcaceaeRuminococcus）、拟杆菌属（Bacteroides）。在经历肝移植IRI后,大鼠粪便内菌群呈现出明显规律性的变化。在门的水平上,厚壁菌门在术后早期（第1天）明显增加,而术后中期（第4天）开始逐渐减少,至术后晚期时（第28天）又开始出现出现增加趋势,而拟杆菌门在此时则完全表现出与厚壁菌门截然相反的变化趋势。在属的层面上,肝移植缺血再灌注术后早期（第1天）乳杆菌属、疣微菌科瘤胃球菌属、拟杆菌属、Blautia的丰度在总菌群中的比例显着增加,普氏菌属、颤螺菌属则明显减低。粪便菌群Alpha多样性分析显示此时菌群的多样性降低。术后中期（第4天）乳杆菌属、疣微菌科瘤胃球菌属开始逐渐降低,普氏菌属、颤螺菌属开始增加,拟杆菌属和Blautia在此期间则先后呈现先增后减的变化趋势,菌群的多样性也开始逐渐增加。至术后晚期（第28天）观察结束时疣微菌科瘤胃球菌属、颤螺菌属、拟杆菌属及Blautia基本恢复至术前水平,普氏菌属在总菌群中的比重仍高于乳杆菌属,但它们之间的差距在进一步缩小,呈现出向术前趋于一致的变化趋势,菌群的多样性仍高于术前水平。[结论]1、SD大鼠自体原位肝移植IRI模型是研究肝移植IRI的理想模型。2、自体原位肝移植IRI可引起粪便内菌群发生变化,且该变化具有明显的规律性。3、大鼠肝脏的IRI在AOLT术后早期表现得最为严重,但恢复也较为迅速。术后中、后期主要表现为AOLT缺血再灌注损伤继发的炎症及肠道管损伤,AOLT缺血再灌注损伤后大鼠粪便菌群的变化与肠道损伤及全身炎症具有一定的相关性。
禹铁牛[3]（2021）在《异甘草素预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤炎症反应及TLR4/NF-κB通路的影响》文中认为【目的】探讨异甘草素预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤炎症反应及TLR4/NF-κB通路的影响。【方法】40只SPF级雄性SD大鼠适应性饲养7天后,按随机数表法随机分成4组,分别为A组（假手术组）、B组（模型组）、C组（50mg/kg异甘草素干预组）、D组（200mg/kg异甘草素干预组）,每组各10只。手术操作前3天,C、D两组分别予以50mg/kg、200mg/kg异甘草素灌胃处理,A组、B组均予以等量生理盐水进行灌胃,四组均按1ml/100g进行灌胃,每日1次,连续3天。A组开腹后解剖肝门,游离出肝左、中叶肝蒂后,不再进一步处理。B、C、D三组,在暴露肝门,游离肝左、中叶肝蒂后,以小号无损伤血管夹夹闭肝蒂肝左、中叶血管,60min后松开血管夹,再灌注6小时。结束灌注后,检测各组大鼠血清转氨酶（ALT、AST）和炎性因子（TNF-α、IL-1β）的变化;检测各组大鼠肝组织氧化应激相关物质丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的含量;HE染色显微镜下检验各组大鼠肝组织形态学变化;WB法检测各组大鼠肝组织TLR4、NF-κB蛋白表达情况。【结果】1、B、C、D三组ALT、AST、TNF-α和IL-1β与A组相比均明显升高（P<0.01）,其中B组大鼠血清ALT（175.49±8.27Kar U）、AST（188.37±9.90Kar U）、TNF-α（49.23±5.58pg/ml）和IL-1β（50.92±20.83pg/ml）与A组ALT（76.42±7.83Kar U）、AST（109.93±8.73Kar U）、TNF-α（26.83±3.64pg/ml）和IL-1β（23.85±2.25pg/ml）比较显着升高（P<0.01）,C组ALT（141.51±12.84Kar U）、AST（154.21±9.48Kar U）、TNF-α（42.00±4.77pg/ml）、IL-1β（39.06±3.48pg/ml）与B组比较,明显降低（P<0.01）,D组ALT（116.10±9.46Kar U）、AST（130.64±8.78Kar U）、TNF-α（32.44±4.16pg/ml）、IL-1β（32.98±2.81pg/ml）与C组比较,明显降低（P<0.05）。2、B、C、D三组SOD与A组相比,均明显降低（P<0.01）,MDA明显升高（P<0.01）。其中B组大鼠肝组织SOD（138.76±7.28U/mgprot）、MDA（5.69±0.25nmol/mgprot）与A组比较,SOD（273.87±11.55U/mgprot）显着降低（P<0.01）、MDA（2.16±0.14nmol/mgprot）显着升高（P<0.01）;与B组比较,C组SOD（188.72±10.84U/mgprot）明显升高、MDA（3.80±0.20nmol/mgprot）明显降低,有显着差异（P<0.01）;与C组比较,D组SOD（227.07±8.99U/mgprot）明显升高、MDA（3.07±0.13nmol/mgprot）明显下降,有统计意义（P<0.05）。3、HE肝组织染色病理学观察及评分结果:（1）病理学观察:A组肝小叶结构、形态大致如常,肝细胞无明显损伤坏死。B组:肝小叶结构模糊欠清,中央静脉和肝窦明显扩张和淤血,肝细胞不同程度损伤坏死。C组:肝细胞的肿胀变性和坏死程度明显减轻。D组:相较于C组肝细胞肿胀、炎性细胞浸润明显减轻。（2）组织病理学评分:B、C、D三组病理评分明显高于A组（P<0.01）。C、D两组评分显着低于B组（P<0.01）。4、WB检测各组大鼠肝脏组织中TLR4和NF-κB的表达:（1）B、C、D三组TLR4蛋白表达水平分别为内参β-actin蛋白的0.534±0.023倍、0.356±0.025倍和0.248±0.025倍,其中B、C两组明显高于A组的0.174±0.039倍（P<0.01）,D组略高于A组无统计意义（P=0.183>0.05）。C、D两组表达水平显着低于B组（P<0.01）。（2）B、C、D三组NF-κB蛋白表达水平分别为内参β-actin蛋白的0.602±0.022倍、0.516±0.015倍和0.378±0.021倍,明显高于A组的0.238±0.024倍（P<0.01）,其中C、D两组表达水平显着低于B组（P<0.01）。【结论】异甘草素可以显着抑制大鼠HIRI炎性反应,其机理可能与下调TLR4/NF-κB信号转导通路蛋白的表达有关,且高剂量（200mg/kg）优于低剂量（50mg/kg）。
钱保林[4]（2021）在《Hic-5基因通过NF-κB及TLR4信号通路调节肝缺血再灌注损伤的机制研究》文中研究说明目的:探究Hic-5基因在肝缺血再灌注损伤（HIRI）中的作用及其潜在机制,丰富HIRI机理,为防治HIRI提供潜在靶点。方法:1.动物实验:将6-8周龄雄性小鼠,包括:野生型（WT）及Hic-5基因敲除型（Hic-5 KO）,进行随机分组。通过阻断肝左叶及中叶构建70%肝缺血小鼠模型,并于不同再灌注时间点收集各组小鼠标本。Western Blot及PCR法检测各组小鼠肝组织中Hic-5的表达情况。HE染色观察HIRI前后肝组织形态学改变。生化仪测定血清中ALT及AST的水平。Western Blot及PCR法测定肝组织中炎性细胞因子的表达情况;免疫组化染色CD11b阳性细胞,观察促炎表型的Kupffer细胞数量。PCR法及ELISA法测定趋化因子表达水平。Tunel染色法观察肝组织中细胞凋亡数量;Western Blot及ELISA法检测凋亡相关蛋白的表达量及活性。免疫组化染色法观察肝组织切片中TLR4阳性细胞数量。Western Blot检测TLR4及FADD等蛋白的表达量。2.细胞实验:原位消化联合离体消化的方式制备肝细胞悬液,Nycodenz梯度离心分离WT及Hic-5 KO小鼠肝星状细胞（HSC）。通过混合气体培养法构建细胞缺氧复氧模型（H/R）。PCR法检测WT及Hic-5 KO HSC中Hic-5的表达。PCR法检测炎症相关细胞因子、TLR4的表达情况。结果:1.动物实验:正常WT小鼠肝组织中Hic-5呈现低表达状态,HIRI模型中,WT小鼠肝组织中Hic-5表达量增加。且随着再灌注时间的增加,Hic-5表现出先升高后降低的趋势,Hic-5表达峰值出现在再灌注后6h。HE染色结果表明,HIRI造成小鼠肝组织局部发生坏死,并且Hic-5 KO小鼠肝组织坏死区域较WT小鼠少。血清ALT及AST在正常组小鼠中均表达较低,在HIRI组中两者均升高,且WT小鼠升高较Hic-5 KO小鼠更为显着。在正常组中WT及Hic-5 KO小鼠炎症相关细胞因子表达较少;在HIRI模型小鼠中,IL-1及IL-6水平显着提高,且以WT小鼠升高为甚。而IL-10则表现为Hic-5 KO小鼠升高较WT小鼠多,差异具有统计学意义。CD11b染色结果提示,HIRI组小鼠肝组织中出现了更多CD11b阳性细胞,且Hic-5 KO小鼠肝组织中CD11b阳性细胞数量较WT小鼠少。进一步研究发现趋化因子在HIRI小鼠中表达上升,且Hic-5缺失抑制趋化因子的上调。Tunel染色结果表明,HIRI后肝细胞出现凋亡,而Hic-5缺失能缓解HIRI带来的肝细胞凋亡。同时Hic-5缺失能抑制凋亡相关蛋白（Cleaved Caspase-3和Caspase-8）表达增加。在HIRI小鼠中,Western Blot检测发现TLR4、FADD、p-p65蛋白表达出现上调,并且Hic-5 KO小鼠上调程度较低。2.细胞实验:成功分离小鼠原代HSC,PCR检测结果提示,正常WT-HSC中Hic-5表达较低,H/R模型中HSC中Hic-5表达显着升高。与动物水平一致,H/R中HSC均表现出IL-1、IL-6表达增加,且WT-HSC增加较为显着。PCR检测结果提示,H/R提高了TLR4的表达,且Hic-5缺失能抑制TLR4的表达上调。结论:1.HIRI能够提高小鼠肝组织中Hic-5的表达;H/R能够提高HSC中Hic-5的表达。2.Hic-5的缺失通过NF-κB及TLR4信号通路缓解肝缺血再灌注带来的炎症、细胞凋亡及肝组织损伤。
高伟东[5]（2020）在《不同提取方式的杜仲提取物对肝缺血再灌注损伤的保护作用研究及机制初探》文中认为目的:探讨杜仲水提取物及醇提取物是否对大鼠肝脏缺血再灌注损伤（HIRI）具有保护作用,如有保护作用何种提取方式的提取物保护效果较好,并分析其可能的原因以及作用机制。方法:（1）64只雄性SPF级大鼠（180g±20g）随机分为8组,每组8只。分别设为假手术组,HIRI组,杜仲水提取物低、中、高剂量组和杜仲醇提取物低、中、高剂量组。其中各杜仲提取物组予相应剂量杜仲提取物对大鼠进行灌胃预处理10天,水提取物及醇提取物三种不同剂量依次为20g生药/kg、40g生药/kg和80g生药/kg,假手术组及HIRI组给予相同剂量生理盐水预处理10天。除假手术组外,其余各组于灌胃第11天建立肝脏缺血再灌注损伤模型。缺血时间为1h,再灌注时间为4h。检测大鼠肝组织中肿瘤坏死因子-a（TNF-a）、白细胞介素-1b（IL-1b）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）表达水平,并制作肝脏HE染色观察肝脏病理改变情况,同时测定血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）水平。（2）40只雄性SPF级大鼠（180g±20g）随机分为5组,每组8只。分别为假手术组,HIRI组,杜仲多糖低、中、高剂量组。杜仲多糖剂量分别为80mg/kg、160mg/kg和320mg/kg。预处理及建立肝脏缺血再灌注损伤模型方式同前。HE染色观察肝组织病理改变情况以及测定血清高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、ALT、AST、TNF-a、IL-1b水平;检测肝组织中活性氧（ROS）、MDA、SOD生成情况以及HMGB1、Toll样受体4（TLR-4）的m RNA及蛋白表达水平,以及肝组织中干扰素调节因子1（IRF-1）、核因子kB-p65（NF-kB p65/p65）、磷酸化p65（P-p65）、My D88、核因子kb抑制蛋白a（IkB-a）、磷酸化IkB-a（P-IkB-a）的蛋白表达水平。结果:1、杜仲不同提取方式提取物对大鼠HIRI保护作用:（1）肝脏结构及功能:与假手术组相比,HIRI组大鼠肝脏肝索明显紊乱、大量炎性细胞浸润、血清ALT和AST水平较假手术组明显升高;各杜仲提取物预处理组较HIRI组大鼠肝索结构整齐、炎性细胞浸润明显减少、ALT、AST表达水平降低,尤以杜仲水提取物高剂量作用最为明显。（2）氧化应激及炎症反应水平测定:相较于假手术组,HIRI组的肝组织匀浆MDA、IL-1b、TNF-a水平明显升高,SOD活性则显着降低（P<0.05）,杜仲提取物预处理组则可抑制由HIRI导致的MDA、IL-1b、TNF-a升高及SOD降低,以杜仲水提取物高剂量（80g生药/kg）作用最明显（P<0.05）。2、杜仲多糖对大鼠HIRI保护作用:（1）肝脏结构和功能:HIRI组可见明显的肝索紊乱、炎性细胞浸润及肝细胞坏死,血清ALT、AST水平较假手术组明显升高。杜仲多糖预处理组大鼠肝组织坏死面积、肝索紊乱及炎细胞浸润程度较HIRI组明显减轻、ALT、AST水平明显降低,尤以杜仲多糖高剂量组改善肝脏结构和功能损伤最为显着。（2）氧化应激及炎症反应水平测定:HIRI组较假手术组肝组织匀浆MDA含量,血清IL-1b、TNF-a水平明显升高,而SOD水平明显降低（P<0.05）;三种杜仲多糖预处理组均可降低MDA、IL-1b、TNF-a水平,并提高SOD水平,以杜仲多糖高剂量组（320mg/kg）作用最为显着（P<0.05）。（3）无菌炎症反应机制相关指标检测:高剂量杜仲多糖可明显减少由HIRI引起的外周血中HMGB1的释放、肝组织ROS生成及IRF-1水平增加。此外,高剂量杜仲多糖预处理可明显减少由HIRI引起的肝组织HMGB1、TLR-4的m RNA及蛋白表达增加,降低My D88、p65蛋白表达水平,抑制P-p65蛋白生成,同时抑制IkB-a蛋白降解及P-IkB-a生成（P<0.05）,抑制HMGB1/TLR-4/NF-kB信号通路。结论:1、杜仲水提取物及醇提取物可通过抗炎、抗氧化发挥对HIRI的保护作用;高剂量杜仲水提物的保护效果最佳。2、杜仲提取物中有效成分杜仲多糖对HIRI具有保护作用,且其含量越高,保护作用越强。其保护机制:①通过增加SOD活性,促进ROS清除发挥抗氧化作用。②通过减少肝细胞内HMGB1合成及释放,抑制TLR-4/NF-kB途径的激活,发挥抗无菌炎症反应的作用。
贾方[6]（2020）在《NOD1受体激动剂保护LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理背景:急性肝衰竭（Acute liver failure,ALF）也称为爆发性肝衰竭或爆发性肝炎,是一种罕见但高致死率的疾病。ALF是一个复杂的累及多器官功能的过程,随着病程的发展,可出现脑水肿、肾功能衰竭、呼吸功能衰竭、血流动力学障碍及凝血障碍。当发生严重的肝功能障碍时,除了对相关并发症的支持治疗及护理,肝移植仍是治疗急性肝衰竭的最终手段,但是因为移植条件的限制,只有不到10%的肝移植患者因为急性肝衰竭得到移植治疗。因此迫切需要探寻治疗急性肝衰竭的新方法。肝脏是机体最大的实质器官,其中富含免疫细胞,肝脏局部的免疫状态需要进行非常精细的调节来达到自身的免疫稳态,而急性肝衰竭形成的一个重要条件就是免疫细胞过渡活化,形成炎症风暴,攻击肝细胞而导致其凋亡、坏死,最终导致肝功能衰竭。小鼠LPS（lipopolysaccharide）/D-GalN（D-galactosamine hydrochloride）模型目前被广泛用于急性肝衰竭的机制和药物开发当中。LPS与LBP（LPS-binding protein）结合后进一步与肝脏枯否细胞（Kupffer cells）上的Toll样受体4（TLR4）结合激活免疫反应,进而产生大量的炎症因子,这其中在早期分泌的TNF-α起主导作用,其可与肝细胞表面的TNFR1结合而诱发细胞毒性作用,通过上调凋亡相关蛋白的表达而导致肝细胞凋亡异常增加。NOD1受体是模式识别受体NLRs（NOD-like receptors）家族的重要成员,其可通过感应病原菌或肠道共生菌的细胞壁成分肽降解产物二氨基庚二酸（Diaminopimelic acid,DAP）来激活免疫细胞。NOD1蛋白在机体中表达非常广泛,除免疫细胞外,在各组织细胞中如上皮细胞、基质细胞、内皮细胞中均可表达。不仅肝脏免疫细胞可以表达NOD1受体,占肝脏细胞总量70%的肝实质细胞也可表达NOD1受体,并且在肝脏的免疫防御中也充当着重要的作用。因此,NOD1受体的活动与肝脏的免疫状态息息相关。由于既往尚未报道过NOD1受体在急性肝衰竭中的作用,其在急性肝衰竭中的作用机制尚不清楚。因此,探讨NOD1受体在急性肝衰竭中的调控作用及潜在机制对急性肝衰竭的防治具有重要的意义。第一部分NOD1受体激动剂预干预可减轻LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭目的:本课题主要为探索NOD1受体的预先激活对LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭的可能影响;预先干预NOD1受体激动剂是否可以拮抗LPS/D-GalN诱导的肝细胞死亡,同时尝试阐明其中的可能机制,从而探讨NOD1受体在肝脏中的功能及在急性肝衰竭的临床防治提供新的思路。方法:1.使用不同剂量的NOD1受体激动剂——C14-Tri-LAN-Gly,（5μg/只、10μg/只）腹腔注射预先干预小鼠6h后,LPS（7.5μg/kg）/D-GalN（500mg/kg）联合腹腔注射诱导ALF,对照组注射等体积的PBS,连续观察36小时,制作生存曲线,了解NOD1受体激动剂预干预对小鼠生存率的影响。2.使用C14-Tri-LAN-Gly腹腔注射预先干预小鼠6h后,LPS/DGalN联合腹腔注射诱导ALF,对照组注射等体积的PBS,检测血清ALT水平,肝组织H&E染色,了解NOD1预干预对LPS/D-GalN诱导的肝损伤的影响。3.对比NOD1激动剂预干预后小鼠的肝组织TUNEL染色结果,另外提取小鼠肝组织的总蛋白,通过Western blot检测凋亡相关蛋白的表达,以确定NOD1激动剂预干预对肝细胞凋亡的影响。4.C14-Tri-LAN-Gly预干预后6小时,再LPS/D-GalN联合注射后2小时后收集小鼠血清及肝组织,Elisa检测血清及肝组织匀浆中的TNF-α水平。分离小鼠肝脏的单个核细胞,流式细胞术检测肝脏中免疫细胞频数及其表面CD69的表达情况,使用流式细胞术检测F4/80阳性细胞上TLR4的表达是否存在差异。结果:1.两种剂量的C14-Tri-LAN-Gly预干预后,小鼠对LPS/D-GalN诱导ALF后的36小时生存曲线与对照组相比存在明显差异,提示NOD1激动剂预干预可明显改善LPS/D-GalN导致的小鼠死亡。2.LPS/D-GalN联合诱导急性肝衰竭后,C14-Tri-LAN-Gly预干预的小鼠血清ALT水平明显降低,肝组织H&E染色提示肝脏组织坏死及炎症减少。3.C14-Tri-LAN-Gly预干预的小鼠其肝组织TUNEL染色提示肝细胞凋亡减少,Western blot结果显示凋亡蛋白cleaved caspase-3表达下调。4.C14-Tri-LAN-Gly预干预的小鼠外周血及肝组织内TNF-α水平未见明显变化,流式细胞检测到肝组织内NK、NKT、T细胞频数及其表面CD69的表达也未变化。Kupffer细胞表面的TLR4水平并未下调。结论:NOD1受体激动剂预干预可改善LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭,并且NOD1激动剂干预后不影响TNF-α的分泌及Kupffer细胞表面TLR4的表达。第二部分NOD1受体激动剂通过上调抗凋亡分子A20的表达拮抗LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭目的:1.通过NOD1激动剂干预TNF-α/D-GalN诱导的急性肝衰竭来进一步探索其保护机制。2.检测NOD1激动剂干预后肝脏抗凋亡分子的表达来探索其抗凋亡作用机制。3.进一步阐述NOD1激动剂保护LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭的机制。方法:1.使用C14-Tri-LAN-Gly预干预小鼠后,观察其对TNF-α/D-GalN诱导的ALF的36小时生存曲线,检测TNF-α/D-GalN注射后6小时血清ALT水平、肝组织H&E染色、肝组织TUNEL染色和肝组织凋亡蛋白的表达。2.C14-Tri-LAN-Gly及LPS/D-GalN干预后,分离小鼠肝实质细胞,使用anti-TNFR1流式抗体标记细胞,流式细胞术检测肝实质细胞表面的TNFR1的表达情况。3.Western blot及RT-qPCR检测诱导小鼠肝组织内抗凋亡分子的表达情况。4.单独使用C14-Tri-LAN-Gly干预小鼠,Western blot及RT-qPCR检测抗凋亡分子A20的表达。5.shRNA尾静脉水动力高压注射干扰小鼠肝脏A20表达,检测干扰A20表达后肝组织损伤及细胞凋亡情况。6.提取小鼠原代肝实质细胞,使用C14-Tri-LAN-Gly体外刺激小鼠原代肝实质细胞,检测体外直接刺激肝实质细胞后A20的mRNA及蛋白水平表达变化。7.使用clodronate-liposomes尾静脉注射清除小鼠Kupffer细胞,之后注射C14-Tri-LAN-Gly诱导A20表达上调,检测清除Kupffer细胞对A20表达的影响。结果:1.C14-Tri-LAN-Gly预干预可改善TNF-α/D-GalN诱导的急性肝衰竭的小鼠生存率,可降低血清ALT水平,减少肝脏损伤,降低肝细胞的凋亡。2.小鼠肝实质细胞表面的TNFR1的表达并未因为C14-Tri-LANGly受到明显影响。3.C14-Tri-LAN-Gly预干预后小鼠肝组织抗凋亡分子A20的mRNA及蛋白水平表达均明显上调。4.使用C14-Tri-LAN-Gly单独干预小鼠,同样发现A20的蛋白及mRNA水平明显上调。5.shRNA干扰小鼠肝脏A20表达后,C14-Tri-LAN-Gly对LPS/DGalN的保护作用被废除。6.体外C14-Tri-LAN-Gly刺激原代肝实质细胞,未发现A20的mRNA或蛋白表达上调。7.Kupffer细胞清除后废除了C14-Tri-LAN-Gly诱导的小鼠肝脏A20的mRNA及蛋白表达上调。结论:NOD1受体激动剂通过上调肝细胞抗凋亡分子A20的表达拮抗LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭,而这种作用是通过肝内Kupffer细胞介导的。
牟童[7]（2020）在《miR-27a-3p抑制OTULIN加重小鼠肝缺血再灌注损伤的机制研究》文中认为目的:1.探讨肝缺血再灌注体内外模型中miR-27a-3p、OTULIN表达水平的变化情况,明确miR-27a-3p对OTULIN的靶向作用。2.研究miR-27a-3p、OTULIN对肝缺血再灌注体内模型炎性因子释放、肝功能损害及肝脏组织学改变的影响。3.分析miR-27a-3p靶向作用OTULIN在肝缺血再灌注体外模型中的具体分子机制。方法:1.建立肝缺血再灌注体内外模型,采用qRT-PCR分析模型各时间点miR-27a-3p、OTULIN mRNA表达水平变化;双荧光素酶报告实验检验miR-27a-3p对OTULIN的靶向作用。2.通过miR-27a-3p antagomir、miR-27a-3p agomir、ADV-OTULIN调节肝缺血再灌注体内模型中miR-27a-3p与OTULIN的表达水平,采用微板法检测血清AST、ALT水平,ELISA检测血清IL-6、TNF-α水平,HE染色观察小鼠肝脏组织损伤情况。3.通过miR-27a-3p antagomir、miR-27a-3p agomir、ADV-OTULIN调节肝缺血再灌注体外模型中miR-27a-3p与OTULIN的表达水平,western blotting检测OTULIN、NF-κB信号通路相关蛋白、Met1-Linked泛素化水平的表达以及p65入核程度的变化;免疫共沉淀检测OTULIN与HOIP的相互作用;ELISA检测细胞上清IL-6、TNF-α水平。结果:1.qRT-PCR结果显示,肝缺血再灌注体内外模型中miR-27a-3p的表达水平随时间逐渐下降,OTULIN的表达水平则随时间逐渐上升。双荧光素酶报告实验结果显示miR-27a-3p agomir能够显着的抑制OTULIN野生型（WT）共同转染组中的荧光素酶活性。2.微板法检测结果显示,在肝缺血再灌注体内模型中下调miR-27a-3p,可以显着的降低血清AST、ALT的表达水平;过表达的OTULIN则可以逆转miR-27a-3p上调导致的AST、ALT血清表达水平增加。ELISA检测结果显示下调的miR-27a-3p可以显着的降低血清IL-6、TNF-α的表达水平;过表达的OTULIN则可以逆转miR-27a-3p上调导致的IL-6、TNF-α血清表达水平增加。HE染色结果显示下调的miR-27a-3p可以显着的缓解模型肝脏组织损伤,过表达的OTULIN则可以逆转miR-27a-3p上调导致的肝脏组织损伤加重。3.免疫共沉淀显示,OTULIN可以在RAW264.7细胞中与HOIP直接结合。Western blotting结果显示,下调的miR-27a-3p可以抑制NF-κB信号通路相关蛋白、Met1-Linked泛素化水平的表达以及p65的入核并促进OTULIN的表达;过表达的OTULIN则可以逆转miR-27a-3p上调导致的NF-κB信号通路相关蛋白、Met1-Linked泛素化水平表达以及p65入核程度的增加以及OTULIN表达降低。ELISA检测结果显示下调的miR-27a-3p可以抑制细胞上清中IL-6、TNF-α的释放,过表达的OTULIN则可以逆转miR-27a-3p上调导致的IL-6、TNF-α分泌增多。结论:1.miR-27a-3p可以靶向作用于OTULIN,肝缺血再灌注体内外模型中miR-27a-3p表达水平明显随时间下降,OTULIN表达水平明显随时间上升。2.miR-27a-3p可以通过介导OTULIN加重小鼠肝缺血再灌注损伤。3.miR-27a-3p可以通过介导OTULIN促进巨噬细胞RAW264.7的泛素化水平进而激活NF-κB信号通路。
张浩[8]（2020）在《乔松素预处理对肝缺血再灌注损伤的作用及机制研究》文中研究说明目的:研究乔松素（Pinocembrin,PIN）预处理对肝缺血再灌注损伤（hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI）的保护作用及可能的分子机制。方法:实验分为体内实验和体外实验两部分构成。第一部分为体内实验:（1）建立小鼠肝缺血再灌注模型:选取40只8周龄的C57小鼠,用血管夹阻断肝左叶与中叶的血流造成70%的肝缺血,建立肝缺血再灌注损伤模型;分为假手术组（Sham组）、缺血再灌注组（I/R组）、低浓度乔松素预处理组（I/R+PIN40组）、高浓度乔松素预处理组（I/R+PIN80组）,缺血1小时后再恢复灌注6小时,然后采集血液及肝组织标本;（2）通过试剂盒检测各组血清中谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）含量;（3）对各组肝脏标本进行HE染色,评估肝组织损伤情况;（4）通过试剂盒检测各组肝组织中超氧化物歧化酶（SOD）、还原性谷胱甘肽（GSH）和脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的含量;（5）采用Tunel染色法检测肝组织中细胞凋亡情况;（6）采用免疫组化法检测肝组织中TLR4的表达情况,并采用蛋白免疫印迹法检测肝组织中凋亡相关蛋白（Bcl-2和Bax）和HMGB1/TLR4炎症通路蛋白的表达。第二部分为体外实验:（1）采用CCK-8法检测不同浓度的乔松素在体外对AML12小鼠肝细胞增殖的影响;（2）建立H2O2刺激的小鼠肝细胞模型来模拟肝缺血再灌注时细胞的反应;分为空白对照组（Control组）、乔松素组（PIN40组）、过氧化氢组（H2O2800组）和乔松素+过氧化氢组（PIN40+H2O2800组）;（3）通过DCFH-DA染色检测各组肝细胞模型中的活性氧含量;（4）通过Hoechst染色检测各组肝细胞模型中的细胞凋亡情况;（5）采用免疫印迹法检测各组细胞模型中凋亡相关蛋白（Bcl-2和Bax）和HMGB1/TLR4炎症通路蛋白的表达情况。结果:体内实验结果显示:（1）成功建立小鼠HIRI的动物模型;（2）乔松素预处理组血清AST和ALT含量较I/R组明显降低;（3）乔松素预处理组中肝脏组织结构的病理变化明显轻于I/R组;（4）乔松素预处理组中肝组织的GSH和SOD含量较I/R组明显增高,而MDA含量较I/R组明显降低;（5）与I/R组相比,乔松素预处理组中肝组织的抑凋亡蛋白Bcl-2的表达明显升高,促凋亡蛋白Bax表达明显降低;（6）与I/R组相比,乔松素预处理组中肝组织的HMGB1/TLR4炎症通路蛋白的表达水平明显降低。体外实验结果显示:（1）在12、24、48小时的不同时间段内,40μmol/L浓度范围内的乔松素溶液对小鼠肝细胞的增殖无影响;（2）乔松素预处理组（PIN40+H2O2800组）中肝细胞的活性氧含量明显低于双氧水处理组（H2O2800组）;（3）与双氧水处理组（H2O2800组）相比,乔松素预处理组（PIN40+H2O2800组）中肝细胞的凋亡细胞明显减少;（4）PIN40+H2O2800组中肝细胞的抑凋亡蛋白Bcl-2表达水平较H2O2800组明显增高,促凋亡蛋白Bax表达水平较H2O2800组明显降低;（5）与H2O2800组相比,PIN40+H2O2800组中肝细胞HMGB1/TLR4炎症通路蛋白的表达水平明显降低。结论:乔松素预处理能够改善HIRI导致的肝脏损伤,其可能的机制与乔松素减轻氧化应激、抑制凋亡,抑制HMGB1/TLR4炎症通路的激活有关。
闫珍珍[9]（2019）在《Tollip在肝脏缺血再灌注损伤中的功能和机制研究》文中认为肝脏缺血再灌注损伤（Ischemia reperfusion injury,IRI）是出血热休克、肝脏切除和肝脏移植手术的主要并发症,临床上缺乏有效的治疗方法。肝脏IRI呈现动态的过程,包括局部缺血损伤和炎症介导的再灌注损伤两个阶段。在肝脏缺血阶段,缺氧导致肝细胞内线粒体氧化磷酸化功能低下、三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate,ATP）迅速耗尽、酸性物质大量积累、Ca2+超载等,引发肝实质细胞的初步损伤;在再灌注时期,血液的重新输入,导致大量的活性氧自由基（Reactive oxygen species,ROS）产生、Kupffer细胞活化、炎症相关因子增多、细胞黏附因子的表达增加,进而促进中性粒细胞活化和向损伤肝细胞的浸润,释放有毒物质,导致肝细胞的凋亡和坏死。大量研究表明,再灌注期的炎症反应和细胞死亡是肝脏IR导致的组织破坏的主要原因。因此,寻找对肝脏IRI的过程高度敏感并密切调控这些病理特征的因子是开发治疗肝脏IRI方法的迫切需要。Tollip（Toll-interacting protein）是和白介素1受体相关蛋白（Interleukin-1receptor accessory protein,IL-1RAcP）胞质部分相互作用的一个蛋白,在炎症通路中发挥复杂的调控功能。在Toll-like信号通路中,Tollip扮演负调控因子的角色,抑制Toll信号通路的发生。然而在肝脏组织中,Tollip的缺失能够通过阻断ROS的生成来减弱炎症因子的表达。另一方面,Tollip通过调控PI3K-Akt和核转录因子kappa B（Nuclear factor kappa B,NF-κB）信号通路在心肌梗死和脑中风疾病模型中发挥其促进细胞炎症和凋亡的功能。由此可知,Tollip在调控细胞炎症和凋亡方面具有重要的作用,但是关于Tollip在肝脏IRI发生中的功能还未见报道。本研究应用了多种组学方法系统地分析了肝脏IRI发生的主要诱发因素和潜在的治疗靶点。通过蛋白质组学分析,我们发现Tollip蛋白的表达与肝脏IRI过程密切相关。利用Tollip敲除（Tollip knockout,Tollip-KO）小鼠和Tollip下调的肝细胞,我们证实肝细胞Tollip在IRI病理过程中发挥重要的调控作用。进一步通过表型评价结合RNA-seq数据分析,我们发现肝细胞Tollip缺失能够抑制细胞死亡和炎症反应,显着减轻IR诱导的肝损伤。分子机制研究表明,Tollip能够和细胞凋亡信号调节激酶1（Apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1）相互作用,促进肿瘤坏死因子受体相关因子6（Tumor necrosis factor receptor associated factor 6,TRAF6）招募到ASK1上,从而增强ASK1的N端二聚化并激活ASK1下游的c-jun氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase,JNK）/p38信号通路。Tollip的MF基序和TRAF6的自身泛素链的形成则是Tollip调控ASK1-丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases,MAPK）通路所必需的。我们的研究证实Tollip在肝脏IRI发生中发挥重要功能,Tollip的缺失通过抑制ASK1-JNK/p38信号通路激活减轻肝脏IRI。抑制Tollip或其与ASK1的相互作用可能成为治疗肝IR损伤的有效方法。
钟祥[10]（2019）在《TAK242对大鼠心脏死亡供肝缺血再灌注损伤的保护作用研究》文中认为研究背景:肝移植是治疗终末期肝脏疾病的有效治疗手段,脑死亡器官捐献（Donation after brain death,DBD）早已无法满足日益增加的供肝需求,而心脏死亡器官捐献（Donation after cardiac death,DCD）是解决供肝短缺的重要渠道。缺血再灌注（Ischemia reperfusion,IR）损伤是指器官在缺血后恢复灌注,出现损伤不但没有减轻反而进一步加重的情况;IR损伤是导致移植术后移植肝无功能以及急慢性排除反应发生的重要危险因素,与DBD肝脏相比,DCD肝脏具有更长的热缺血时间,在移植过程中对IR损伤更加敏感。研究目的:IR损伤过程中出现的无菌炎症反应是导致组织损伤的重要原因,高迁移率族蛋白1（High mobility group box 1,HMGB1）是具有参与DNA修复,转录以及细胞信号转导等重要功能的核蛋白,与TLR4结合可以诱导固有免疫,参与多种疾病的病生过程。本研究旨在探究HMGB1/TLR4信号通路在大鼠DCD供肝的IR损伤中的影响及机制。研究方法:使用TLR4特异性抑制剂TAK242。SD雄性大鼠随机分为4组:对照组,给药组,DCD组,DCD给药组。根据分组给予TAK242或者DMSO生理盐水预处理,并根据分组确定热缺血时间,肝脏获取后保存在4℃UW液24小时,然后使用大鼠肝脏离体灌注系统进行灌注1小时,获取灌注液及组织标本。通过HE染色,肝酶水平检测肝组织损伤情况,使用Tunel法检测肝细胞凋亡情况,通过组织MDA,ROS水平,电镜观察亚细胞结构检测组织氧化应激程度,使用荧光定量PCR和Western blot检测HMGB1,TLR4和下游炎症因子表达水平和蛋白水平。结果:DCD组肝脏的组织损伤,肝酶水平,凋亡率明显高于对照组正常肝脏且HMGB1,TLR4,以及下游炎症因子IL-1β,IL-6,TNF-α,COX2的表达水平和蛋白水平均高于对照组。阻断TLR4通路明显减轻了DCD肝脏组织损伤情况,肝酶水平和肝细胞凋亡率;降低了DCD肝脏TLR4和下游炎症因子IL-1β,IL-6,TNF-α,COX2的表达水平和蛋白水平,但对DCD肝脏的HMGB1表达和蛋白水平无明显影响。阻断TLR4通路后DCD肝脏的组织损伤,肝酶水平和肝细胞凋亡率以及HMGB1,TLR4,以及下游炎症因子IL-1β,IL-6,TNF-α,COX2的表达水平和蛋白水平仍要高于阻断TLR4通路后的正常肝脏。阻断TLR4通路对大鼠正常供肝无明显影响,肝脏组织损伤,肝酶水平,肝细胞凋亡率以及通路相关因子的表达和蛋白水平与大鼠正常肝脏均无明显差异。结论:本实验表明TLR4信号通路在大鼠DCD肝脏的IR损伤中发挥重要作用,TAK242通过阻断TLR4信号通路减轻了大鼠DCD的IR损伤,对改善DCD供肝质量可能具有潜在的帮助。
二、大鼠肝移植缺血再灌注后Kupffer细胞Toll样受体4及其伴侣分子MD-2的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大鼠肝移植缺血再灌注后Kupffer细胞Toll样受体4及其伴侣分子MD-2的表达（论文提纲范文）
（1）杜仲桃叶珊瑚苷对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 中药杜仲对肝缺血再灌注损伤保护作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）SD大鼠自体原位肝移植缺血再灌注损伤后粪便菌群的变化规律（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 肠道微生物与肝病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（3）异甘草素预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤炎症反应及TLR4/NF-κB通路的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表(Abbreviation) |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 大鼠血清 AST 与 ALT 结果 |
| 3.2 大鼠血清 TNF-α与 IL-1β水平 |
| 3.3 大鼠肝组织 SOD 与 MDA 的含量 |
| 3.4 大鼠肝组织 HE 染色病理学观察及评分 |
| 3.5 WB 检测肝组织 TLR4 和 NF-κB 蛋白表达 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 大鼠肝脏缺血再灌注模型的建立与鉴定 |
| 4.2 血清ALT、AST与 HIRI的关系 |
| 4.3 血清TNF-α、IL-1β与 HIRI的关系 |
| 4.4 肝组织中 SOD 和 MDA 与 HIRI 的关系 |
| 4.5 TLR4/NF-κB 分子信号转导通路与 HIRI 的关系 |
| 4.6 异甘草素对HIRI的保护作用 |
| 4.7 异甘草素对 HIRI 中 TLR4/NF-κB 信号转导通路的影响 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 TLR4/NF-κB信号转导通路在肝缺血再灌注损伤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）Hic-5基因通过NF-κB及TLR4信号通路调节肝缺血再灌注损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照表 |
| IL-1家族细胞因子在肝脏疾病中的研究进展 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（5）不同提取方式的杜仲提取物对肝缺血再灌注损伤的保护作用研究及机制初探（论文提纲范文）
| 中英缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分:两种不同提取工艺的杜仲粗提物对肝脏缺血再灌注损伤保护作用的比较 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分:杜仲多糖在大鼠肝脏缺血再灌注损伤中的保护作用及机制探讨 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）NOD1受体激动剂保护LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 NOD1 受体激动剂预干预可减轻LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 NOD1 受体激动剂通过上调抗凋亡分子A20 的表达拮抗LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述:模式识别受体与肝脏疾病研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
（7）miR-27a-3p抑制OTULIN加重小鼠肝缺血再灌注损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 miR-27a-3p通过介导OTULIN加重小鼠肝脏缺血再灌注损伤 |
| 第一节 下调miR-27a-3p减轻小鼠肝缺血再灌注损伤 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 第二节 miR-27a-3p通过介导OTULIN加重小鼠肝缺血再灌注损伤 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 讨论 |
| 第二章 肝缺血再灌注体外模型中miR-27a-3p通过介导OTULIN促进Met1-Linked泛素化水平激活NF-κB信号通路 |
| 第一节 下调miR-27a-3p通过降低Met1-Linked泛素化水平抑制NF-κB信号通路的激活 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 第二节 miR-27a-3p通过介导OTULIN促进Met1-Linked泛素化水平激活NF-κB信号通路 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述:肝缺血再灌注损伤的细胞及分子机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（8）乔松素预处理对肝缺血再灌注损伤的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 乔松素预处理对小鼠肝缺血再灌注损伤的影响 |
| 材料与方法 |
| 1 实验对象 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 乔松素单体 |
| 2 主要实验试剂 |
| 2.1 主要实验试剂 |
| 2.2 主要实验试剂的配制 |
| 3 主要实验仪器 |
| 4 实验方法 |
| 4.1 小鼠缺血再灌注损伤模型的建立及预处理 |
| 4.2 灌注固定和取材 |
| 4.3 血清中AST和 ALT活性检测 |
| 4.4 肝组织中氧化应激指标检测 |
| 4.5 蛋白免疫印迹法测定蛋白表达 |
| 4.6 Tunel凋亡检测 |
| 4.7 免疫组化染色 |
| 5 统计学方法 |
| 结果 |
| 1 成功建立C57 小鼠肝缺血再灌注损伤模型 |
| 2 乔松素能够改善缺血再灌注引起的肝脏损伤 |
| 3 肝脏的形态学变化 |
| 4 乔松素能够减轻HIRI的氧化应激水平 |
| 5 乔松素能够影响IRI中肝细胞的凋亡 |
| 6 乔松素通过影响HMGB1/TLR4 炎症通路蛋白的表达减轻HIRI |
| 第二部分 乔松素减轻肝缺血再灌注损伤的机制 |
| 材料与方法 |
| 1 实验所用细胞系 |
| 2 主要实验试剂 |
| 2.1 主要实验试剂 |
| 2.2 实验试剂的配置 |
| 3 主要实验设备 |
| 4 实验方法 |
| 4.1 AML12小鼠肝细胞的培养、传代、冻存和复苏 |
| 4.2 CCK-8检测不同浓度乔松素对细胞增殖的影响 |
| 4.3 AML12小鼠肝细胞分组 |
| 4.4 AML12小鼠肝细胞活性氧检测 |
| 4.5 AML12小鼠肝细胞凋亡检测 |
| 4.6 蛋白免疫印迹法测定蛋白表达 |
| 5 统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照表 |
| 肝缺血再灌注损伤机制及应对措施 综述 |
| 1 HIRI的发生机制 |
| 1.1 代谢性酸中毒 |
| 1.2 钙超载 |
| 1.3 线粒体膜通透性的改变 |
| 1.4 库普弗细胞的激活 |
| 1.5 中性粒细胞及淋巴细胞的激活 |
| 1.6 细胞因子和补体的产生 |
| 1.7 OFR的失衡 |
| 1.8 黄嘌呤氧化酶活性的增强 |
| 2 应对措施 |
| 2.1 手术干预 |
| 2.2 药物干预 |
| 2.3 其它选择 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（9）Tollip在肝脏缺血再灌注损伤中的功能和机制研究（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 研究背景 |
| 1.肝脏缺血再灌注损伤 |
| 1.1.肝脏缺血再灌注损伤概述 |
| 1.2.肝脏IRI的发病机制 |
| 1.2.1.代谢性酸中毒 |
| 1.2.2.钙离子超载 |
| 1.2.3.线粒体 |
| 1.2.4.NO和ET的失衡 |
| 1.2.5.氧化应激 |
| 1.2.6.KCs的活化和炎症因子的释放 |
| 1.2.7.PMNs的激活和浸润 |
| 1.3.肝脏IRI的治疗策略 |
| 1.3.1.缺血预处理 |
| 1.3.2.药理学处理 |
| 1.3.3.基因治疗 |
| 2.Tollip蛋白 |
| 2.1.Tollip蛋白简介 |
| 2.2.Tollip蛋白和炎症、凋亡 |
| 3.MAPKs信号通路 |
| 3.1.MAPKs信号通路概述 |
| 3.2.MAPKs信号通路的主要途径 |
| 3.2.1.细胞外信号调节激酶1/2信号通路 |
| 3.2.2.c-jun氨基末端激酶信号通路 |
| 3.2.3.p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路 |
| 3.2.4.细胞外信号调节激酶5信号通路 |
| 3.3.MAPKs与肝脏IRI |
| 3.4.ASK1的活化 |
| 4.研究思路及意义 |
| 第二章 实验材料、试剂与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1.表达载体克隆材料 |
| 1.2.动物实验材料 |
| 1.3.生物信息学材料 |
| 1.4.病理实验材料 |
| 1.5.细胞实验材料 |
| 1.6.免疫共沉淀及免疫印迹实验材料 |
| 1.7.荧光定量PCR实验相关材料 |
| 2.实验试剂 |
| 3.实验方法 |
| 3.1.表达载体克隆实验方法 |
| 3.2.动物实验方法 |
| 3.3.病理实验方法 |
| 3.4.生物信息学方法 |
| 3.5.细胞实验方法 |
| 3.6.分子实验方法 |
| 3.7.统计学方法 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 1.肝脏中Tollip的蛋白表达和肝脏IRI密切相关 |
| 2.Tollip的缺失能够改善IR/HR造成的肝脏/肝细胞损伤 |
| 2.1.Tollip的缺失减弱IR诱导的肝脏损伤 |
| 2.2.TOLLIP下调/缺失降低了HR造成的肝细胞的损伤 |
| 3.Tollip依赖于ASK1-JNK/P38通路来调控肝脏IRI |
| 3.1.Tollip影响由IR激活的MAPK信号通路 |
| 3.2.Tollip的缺失/下调减弱了IR/HR激活的ASK1-JNK/p38信号通路 |
| 4.TOLLIP依赖于其MF基序和TRAF6的泛素链促进ASK1 N端二聚化 |
| 4.1.TOLLIP能够促进ASK1的N端二聚化 |
| 4.2.TOLLIP的MF基序和TRAF6的泛素链对TOLLIP促进ASK1 N端二聚化是必需的 |
| 第四章 研究总结及展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（10）TAK242对大鼠心脏死亡供肝缺血再灌注损伤的保护作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要药品及试剂 |
| 2.1.3 主要实验器材和仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验分组 |
| 2.2.2 动物模型建立 |
| 2.2.3 肝脏保存和离体灌注 |
| 2.2.4 肝脏组织病理切片制作和观察 |
| 2.2.5 肝脏组织免疫组织化学检测和观察 |
| 2.2.6 灌注液肝酶水平检测 |
| 2.2.7 肝脏组织蛋白水平检测 |
| 2.2.8 肝脏组织基因表达水平检测 |
| 2.2.9 肝脏组织细胞凋亡检测 |
| 2.2.10 肝脏组织MDA检测 |
| 2.2.11 肝组织ROS检测 |
| 2.2.12 肝脏组织电镜检测 |
| 2.2.13 统计学方法 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 各组肝脏组织病理学观察结果 |
| 3.2 各组灌注液肝酶检测结果 |
| 3.3 各组肝组织蛋白水平检测结果 |
| 3.4 各组肝组织基因表达水平检测结果 |
| 3.5 各组肝组织细胞凋亡检测结果 |
| 3.6 各组肝组织MDA与 ROS检测结果 |
| 3.7 各组肝组织免疫组化检测结果 |
| 3.8 各组肝组织电镜检测结果 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 第6章 不足与展望 |
| 5.1 研究存在的不足 |
| 5.2 未来研究方向与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
四、大鼠肝移植缺血再灌注后Kupffer细胞Toll样受体4及其伴侣分子MD-2的表达（论文参考文献）
- [1]杜仲桃叶珊瑚苷对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究[D]. 张世龙. 遵义医科大学, 2021(01)
- [2]SD大鼠自体原位肝移植缺血再灌注损伤后粪便菌群的变化规律[D]. 朱宏伟. 昆明医科大学, 2021(02)
- [3]异甘草素预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤炎症反应及TLR4/NF-κB通路的影响[D]. 禹铁牛. 南华大学, 2021
- [4]Hic-5基因通过NF-κB及TLR4信号通路调节肝缺血再灌注损伤的机制研究[D]. 钱保林. 西南医科大学, 2021(01)
- [5]不同提取方式的杜仲提取物对肝缺血再灌注损伤的保护作用研究及机制初探[D]. 高伟东. 遵义医科大学, 2020(12)
- [6]NOD1受体激动剂保护LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭的作用及机制研究[D]. 贾方. 重庆医科大学, 2020(01)
- [7]miR-27a-3p抑制OTULIN加重小鼠肝缺血再灌注损伤的机制研究[D]. 牟童. 重庆医科大学, 2020(01)
- [8]乔松素预处理对肝缺血再灌注损伤的作用及机制研究[D]. 张浩. 西南医科大学, 2020(10)
- [9]Tollip在肝脏缺血再灌注损伤中的功能和机制研究[D]. 闫珍珍. 武汉大学, 2019(06)
- [10]TAK242对大鼠心脏死亡供肝缺血再灌注损伤的保护作用研究[D]. 钟祥. 南昌大学, 2019(01)